1、第1章 緒論 (名詞解釋8個5分 簡答3個十分 論述2個15分)名詞解釋：1. 蛋白質組：指的是由一個細胞、一個組織或是一種生物的基因組所表達的全部相應的蛋白質。是一個整體概念。2. 蛋白質組學：旨在闡明生物體內全部蛋白質的表達模式和功能模式，其內容包括蛋白質的表達與存在方式（修飾方式），結構與功能，以及各個蛋白質之間相互作用等。3. 可變剪接：是指同一基因轉錄形成的RNA前體可經過一種以上剪接方式產生多種不同的mRNA的過程。可將同一基因中的外顯子以不同的組合方式來表現，使一個基因在不同時間、不同環境中能夠制造出不同的蛋白質。從而使蛋白質組的復雜性遠遠高于基因組。4. 蛋白質翻譯后修飾（PT

2、M）：是指對新合成的多肽鏈或蛋白質進行的化學修飾，主要是磷酸化、糖基化、酰基化、硝基化、磺基化、脂化、泛素化和水解修飾等。使數量有限的編碼基因產生數量巨大的蛋白質。簡答題：1. 基因組與蛋白組的區別與聯系（1） 同一性與多樣性：同一個體的基因組不論是在不同的發育階段或不同種類的細胞里都是一樣的；對于不同類型的細胞或同一個細胞在不同的生理狀態下，蛋白質組的構成是不同的（2） 有限性與無限性：基因組無論大小，其核苷酸的數量和序列是一定的，對基因組序列的測定是一種“有限”的工作；由于細胞內大部分蛋白質存在翻譯后修飾，包括磷酸化、糖基化、酰基化等，很難確定蛋白質組的蛋白質數量；對蛋白質組的蛋白質種類的

3、確定是一種“無限”的工作。（3） 靜態與動態：一個個體的基因組自個體誕生到死亡，始終保持不變；個體的蛋白質組，作為新陳代謝的主要執行者，在個體的生命活動中卻總是變動的。（4） 周期性與空間性：基因組通常位于細胞核內，比較穩定，序列和功能一般不受空間的影響，但是在發育的不同階段和不同的細胞周期，mRNA的表達是不一樣的；不同的蛋白質分布在細胞的不同部位，它們的功能與其空間定位密切相關；許多蛋白質在細胞內不是靜止的，他們常常在不同的亞細胞環境里運動而發揮作用。2. 重點：基因組與蛋白組的區別與聯系： 區別/聯系基因組蛋白質組同一性與多樣性同一個體的基因組不論是在不同的發育階段或不同種類的細胞里都是

4、一樣的；對于不同類型的細胞或同一個細胞在不同的生理狀態下，蛋白質組的構成是不同的。有限性與無限性基因組無論大小，其核苷酸的數量和序列是一定的，例如人類基因組長度為32億個堿基對；對基因組序列的測定是一種“有限”的工作。由于細胞內大部分蛋白質存在翻譯后修飾，包括磷酸化、糖基化、酰基化等，很難確定蛋白質組的蛋白質數量；對蛋白質組的蛋白質種類的確定是一種“無限”的工作。靜態與動態一個個體的基因組自個體誕生到死亡，始終保持不變；個體的蛋白質組，作為新陳代謝的主要執行者，在個體的生命活動中卻總是變動的。周期性與空間性基因組通常位于細胞核內，比較穩定，序列和功能一般不受空間的影響，但是在發育的不同階段和不

5、同的細胞周期，mRNA的表達是不一樣的；不同的蛋白質分布在細胞的不同部位，它們的功能與其空間定位密切相關；許多蛋白質在細胞內不是靜止的，他們常常在不同的亞細胞環境里運動而發揮作用。孤立作用與相互作用基因組表達的各種mRNA是彼此孤立的，互不干擾；蛋白質組中的各種蛋白質卻是彼此間有著廣泛的相互作用。單一手段與多種技術在基因組研究中，DNA測序技術是最基本和最主要的工具，因為基因組的均一性和簡單性使得一種單一的技術就能勝任基因組的研究任務；在蛋白質組研究中，需要的研究技術遠遠不止一種，并且技術的難度也遠遠大于基因組的研究技術。第2章 蛋白質概述名詞解釋：1. 等電點：在某一pH的溶液中，氨基酸解離

6、成陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，成為兼性離子，呈電中性。此時溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點。2、蛋白質是一切生物體中普遍存在的，由20種左右天然-氨基酸通過肽鍵相連形成的高分子含氮化合物；簡答題3、氨基酸的分類、光學性質、重要化學反應1）非極性（疏水性）氨基酸(8種）A丙氨酸Ala、V纈氨酸Val、L亮氨酸Leu、I異亮氨酸Ile、F苯丙氨酸Phe、W色氨酸Trp、M甲硫氨酸Met、P脯氨酸Pre2）極性（親水）中性氨基酸7種 G甘氨酸Gly、S絲氨酸Ser、T蘇氨酸Thr、C半胱氨酸Cys、Y酪氨酸Tyr、N天冬酰胺Asn、Q谷氨酰胺Gln3）堿性氨基酸3種 H組氨酸His、K賴氨酸Ly

7、s、R精氨酸Arg4） 酸性氨基酸 D天冬氨酸Asp、E谷氨酸Glu2、光學性質1）除甘氨酸外，所有天然-氨基酸都有不對稱碳原子，這其四個不同的取代基可有兩種不同的空間排列方式，L型和D型。它們具有相反的旋光性，也稱分子手性。 蛋白質分子中的氨基酸一般為L型。2）參與蛋白質組成的20種氨基酸中色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)的R基團中含有苯環共軛雙鍵系統，在紫外光區（220-300nm）顯示特征的吸收譜帶，最大光吸收（max）分別為279、278、和259nm。由于大多數蛋白質都含有這些氨基酸殘基，因此用紫外分光光度法可測定蛋白質含量。3、重要化學反應1）與茚三酮反應:用

8、于氨基酸定量定性測定.2）與2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反應（sanger反應），用于蛋白質N-端測定.3）與苯異硫氰酯（PITC）的反應（Edman反應），用于蛋白N-端測定，蛋白質順序測定儀設計原理的依據。（初級蛋白質測序）除脯氨酸與羥脯氨酸外，可與其它氨基酸生成藍紫色化合物。脯氨酸與羥脯氨酸為黃色化合物。第3章 蛋白質樣品的制備可能會出論述題：蛋白質樣品的制備包含蛋白質分離、提取與純化3個過程。簡答題：1. 樣品制備的原則（1）全息性，盡可能采用簡單方法進行樣品處理，以避免蛋白丟失，盡可能獲得所有的蛋白質。（2）應使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態（包括多數疏水性蛋白），且制備方

9、法應具有可重現性。（3）細胞和組織樣品的制備應盡可能減少蛋白的降解，低溫和蛋白酶抑制劑以防止蛋白的降解。（4）防止樣品在聚焦時發生蛋白的聚集和沉淀。（5）樣品裂解液應該新鮮配置，并且分裝凍存于-80 。勿反復凍融已制備好的樣品。（6）通過超速離心清除所有的非蛋白雜質，盡量去除起干擾作用的高豐度或無關蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性。（7）防止發生人為的蛋白質樣品化學修飾，如加入尿素后加溫不要超過37 ，防止氨甲酰化而修飾蛋白。2.制備流程分為組織活細胞破碎、分離或沉淀蛋白質、純化蛋白質。后兩步往往是結合在一起進行的。1) 組織活細胞破碎的原則是，在整個過程中最大限度的限制蛋白質的水解和其他形

10、式的蛋白質降解。2) 沉淀溶液樣品中的蛋白質，清除雜質是可選擇的步驟，主要依賴于樣品本身和研究目的，通常建議采用最簡單的樣品制備方法。3) 蛋白質的純化是對沉淀的蛋白質進行再溶解，重復沉淀的過程，通常利用沖泡脹溶液稀釋樣品。樣品破碎與分離蛋白質3.組織與細胞破碎（一）溫和的裂解方法通常應用于組分比較簡單的樣品，例如組織培養的細胞、血細胞和一些微生物，或者用于分析某一特定的細胞器，例如只需要裂解胞質蛋白、完整的線粒體或其它的細胞器。（二）劇烈的蛋白裂解常用于難于破碎的細胞，如固體組織內的細胞，或具有堅硬細胞壁的細胞，如酵母細胞，這種方法可以使細胞完全破碎裂解。4、蛋白質沉淀這是一種可選擇的方法。

11、如果樣本十分重要， 想得到完整而精確的樣本蛋白質譜， 應避免使用沉淀和重溶的方法。蛋白質裂解5、裂解液（各組分及其作用）組成成分及作用： 離液劑：通過改變或破壞溶液中的氫鍵等次級鍵使蛋白質充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。尿素是常用的離液劑。 還原劑：還原劑主要是用來斷裂蛋白分子中Cys殘基之間形成的二硫鍵，讓大多數蛋白完全展開，增加蛋白的溶解性。 表面活性劑：表面活性劑主要是通過破壞蛋白之間的疏水相互作用，以確保蛋白完全溶解和防止通過疏水相互作用導致蛋白聚合。（4）起載體作用的兩性電解質：即便在變性劑和表面活性劑存在的情況下，某些蛋白質也需要在鹽離子的作用下才能保持其

12、處于溶解狀態，否則這些蛋白質在其處于PI點時會發生沉淀。樣品預分級6.分步裂解提取 1.目的與原理 由于蛋白質在細胞中存在部位不同，而不同蛋白質的溶解性亦不相同，為了提高雙向電泳的分離效果，有時需要采取分步提取的方法來盡可能的提取更多的蛋白質。 2.方法：分步提取法所采用的裂解液的溶解性能是逐漸增加的。第一步裂解液只含有40mmol/L Tris，其余為去離子水，只溶解偏親水性的蛋白。第二步裂解液屬傳統的裂解方法，含有表面活性劑CHAPS、還原劑DTT、解聚劑Urea等成分，由于具有良好的溶解能力，可以溶解親水性、中性和較疏水性的蛋白。第三步裂解液中添加了能夠促進疏水蛋白質溶解的成分，如表面活

13、性劑SB3-10、還原劑DTT、解聚劑thiourea，主要溶解偏疏水性的蛋白。在多數情況下，大部分蛋白質在第一步和第二步中可被提取。清除影響電泳的圖譜的雜質樣品中的非蛋白的不純物質可能干擾蛋白的分離及二維電泳圖譜的質量，因此，在樣品制備中需考慮清除這些雜質。第四章 蛋白質分離技術1. 雙向凝膠電泳（2-DE)：利用蛋白質的等電點和分子量，結合凝膠化學特性，分離各種蛋白質的方法。基本原理：第一向在高壓電場下對蛋白質進行等電聚焦(IEF), 再在第一向垂直方向上進行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。2. 聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gel, P

14、AG）是通過丙烯酰胺（acrylamide）單體和雙功能團交聯劑如N,N-甲叉雙丙烯酰胺（N,N-methylene bisacrylamide）按一定的比例混合，在引發劑和增速劑存在下聚合而成的交叉網狀結構，使其產生分子篩效應。聚丙烯酰胺凝膠的優點 機械強度高，彈性好，透明，無電滲作用，吸附作用極小； 化學性質穩定，與待分離的物質不起任何化學反應； 樣品不易擴散，用量小； 凝膠孔徑可通過改變單體和交聯劑濃度調節 分辨率高。3、IEF原理等電聚焦電泳（IEF）是利用蛋白質分子或其他兩性分子的等電點的不同，在一個穩定的、連續的、線性pH梯度中進行蛋白質的分離和分析。所以利用等點聚焦技術分析的對象

15、只限于蛋白質和兩性分子。分析的條件是凝膠中有穩定的、連續的和線性的pH梯度。pH值梯度的存在對等電聚焦技術相當重要。在pH梯度凝膠內，在電場作用下，蛋白質分子能向使它們所帶凈電荷為零的點移動。 這就是等電聚焦效應。1）pH梯度的形成在電場下載體兩性電解質的變化 天然pH梯度法：在沒有電場時,載體兩性電解質溶液的pH值大約是該溶液pH范圍的平均值(如pH3-10的載體兩性電解質溶液,其pH約為6.5左右)。所有載體兩性電解質分子都帶有電荷,只是在溶液中的正電荷和負電荷數目相等,凈電荷為零。 引入電場時,載體兩性電解質分子分別向陰極和陽極移動,最終在分子凈電荷為零的位置停止遷移。2）pH梯度的形成

16、過程 pH梯度形成的時間,視正負電極之間的距離和凝膠的厚度而定。一般一塊長12cm的玻璃,電極間的有效距離為10cm，凝膠的厚度為1mm，使用Ampholine為載體兩性電解質,電泳1小時后pH梯度基本形成，2小時后無多大變化,如圖3）載體兩性電解質的缺點n利用了合成載體兩性電解質（SCA）來生成pH梯度，合成過程復雜，重復性小。nSCA的pH梯度不穩定且分子小易漂移，難以固定在IEF膠內，由于水合正離子引起的電滲流導致陰極漂移現象，是pH的不穩定性增加。n負極漂移作用對堿性區蛋白質的影響很大。3. 固相pH梯度(IPG)原理：它利用一系列具有弱酸或弱堿的丙烯酰胺衍生物滴定時，在滴定終點附近形

17、成pH梯度，然后將其共價鍵合在介質上，成為凝膠介質的一部分，從而形成固定的，不隨環境電場等條件變化的PH梯度。4. SDS-PAGE電泳：原理：1）蛋白質分子解聚成亞基，解聚后的氨基酸側鏈與SDS充分結合形成帶負電荷的蛋白質-SDS膠束，所帶的電荷大大超過了蛋白質分子原有的電荷量，這就消除了不同分子之間原有的電荷差異。 2）緩沖系統的選擇：一般來說，在被分析的蛋白質穩定的PH范圍，凡不與SDS發生相互作用的緩沖液都可以使用。 3）凝膠濃度的選擇：由于SDS電泳分離并不取決于蛋白質的電荷密度，只取決于分子解聚后SDS-蛋白質膠束的大小，因此凝膠濃度的正確選擇尤為重要。不同分子質量范圍的蛋白質應選

18、用不同的凝膠濃度。5. 雙向電泳的局限性：(1) SDS等去污劑對蛋白質的變性作用是不可逆的。(2) 疏水性蛋白質因不能溶于SDS而不適合作2-DE；PI值<3或>11的蛋白質；分子量過大或過小的蛋白質；低豐度蛋白質<1ng，都很難被檢測到。(3) 樣品上樣量相對少，使檢測的靈敏度受到限制。(4) 電泳結果需經染色處理，不能直接分析，不同蛋白質與染料的結合差異較大。(5) 不能高通量分析，且耗時。(6) 目前尚不能實現完全自動化處理。第六章 層析技術名詞解釋：1、 層析法基本原理層析法是利用混合物中各組分物理、化學性質的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數等）

19、，使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流動相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動而達到分離的目的。吸附層析技術包括吸附柱層析、薄層層析、聚丙烯酰胺層析和疏水層析等。2、 吸附柱層析層析的原理： 利用固定相的固體吸附劑表面對不同組分吸附力的大小及洗脫液對它的溶解度的差異進行分離。3、 薄層層析(Thin layer chromatography)采用的機制及按固定相的分類薄層層析是以涂布于玻板或滌綸片等載體上的基質為固定相，以液體為流動相的一種層析方法。薄層層析可根據固定相的種類分為吸附薄層層析（吸附劑為固定相） 、分配薄層層析（固定在支持劑上的水溶液或有

20、機溶劑為固定相）和離子交換薄層層析（離子交換劑為固定相）等。4、 聚酰胺薄膜層析的原理： 聚酰胺對極性物質的吸附作用是由于它能和被分離物之間形成氫鍵，對極性物質有很強的吸附作用。這種氫鍵的強弱就決定了被分離物與聚酰胺薄膜之間吸附能力的大小。 被分離物質與酰胺基團形成氫鍵能力的強弱，確定了吸附能力的差異。在層析過程中，展層溶劑與被分離物質在聚酰胺表面競相形成氫鍵，選用適當的展層溶劑，使被分離的各種物質在溶劑與聚酰胺表面之間的分配系數有較大差異經過吸附與解吸的展層過程，形成一個分離順序，彼此分開。5、 疏水層析的原理： 在高離子強度的鹽水溶液淋洗條件下，蛋白質的疏水部分與填料表面的疏水基團相互作用

21、而被吸附。淋洗液的離子強度降低，蛋白質依疏水性特征依次被洗脫。即高鹽濃度吸附，低鹽濃度洗脫。6、 分配層析技術原理 利用混合物在兩種不相混溶的液相（固定相和流動相）之間的分配系數的不同而達到分離各組分的目的。固定相液體均勻覆蓋于載體表面，流動相流過固定相。7、 凝膠過濾層析原理 凝膠顆粒內部具有多孔網狀結構，被分離的混合物流過層析柱時，比凝膠孔徑大的分子不能進入凝膠孔內，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；比網孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內外，在柱內經過的路程較長移動速度較慢，最后被洗脫出來。8、 離子交換層析的原理原理：是以離子交換劑為固定相，依據流動相中的離子與交換劑上

22、的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法 。 9、 親和層析原理利用生物大分子間特異的親和能力來純化生物大分子，如：抗原和抗體；酶和底物或輔酶或抑制劑；激素和受體等。10.高壓液相層析分類正相色譜法：共價結合到載體上的集團都是極性的基團，流動相的極性比固定相的極性弱；在這種層析過程中非極性分子或極性小的分子比極性大的分子移動的速度快，先從柱中流出來。反相色譜法共價結合到載體上的基團是一些直鏈碳氫化合物，流動相的極性比固定相的極性強。在這種層析過程中，極性大的分子比極性小的分子移動的速度快而先從柱中流出。 第七章 生物質譜技術和蛋白質鑒定名詞解釋：1. 軟源：離子化能量

23、低，產生的碎片少，譜圖簡單，可得到分子離子峰，即得到分子量信息。 硬源：離子化能量高，伴有化學鍵的斷裂，譜圖復雜，可得到分子官能團的信息。2. 質譜圖：以質荷比m/z為橫坐標，以對基峰(最強離子峰，規定相對強度為100%)相對強度為縱坐標所構成的譜圖。3. 生物質譜技術1） 衰變A. 源內衰變技術（in source - decay，ISD ），發生在離子源區域內，時間為激光撞擊之后的幾百納秒之內，是離子的“即刻片段化”。可以通過線性時間飛行質譜中檢測到；可用于鑒定蛋白質；B. 源后衰變技術：樣品分子首先發生離子源內活化，在激光照射的第一秒內發生解吸附的離子與基質之間會發生低能碰撞，使樣品離子

24、活化，進入第一級無電場漂移區時有可能發生裂解。這一過程發生在源內離子化之后，被稱為源后衰變。2）碰撞誘導解離：是通過惰性氣體撞擊，使得多肽的肽鍵斷裂的過程。大分子肽延肽鏈在酰胺鍵處斷裂成肽離子片段，電荷保留在N端的碎片上定名為a,b,c離子；電荷保留于C端的碎片上時稱之為x,y,z離子。主要產生含N端的b型和含C端的y型片段離子。3）串聯質譜：串聯質譜主要由離子源、多級質量分析器及碰撞室組成。第一級質量分析器起質量過濾器作用，即從總離子譜中挑選出需進一步進行結構分析的母離子進入碰撞室，母離子在高速惰性氣體碰撞誘導解離產生碎片即子離子，由第二級質量分析分析子離子的質荷比。通過分析母離子與子離子的

25、質量，研究二者關系及母離子的裂解規律，可以獲得母離子的結構信息。4、肽質量指紋譜PMF：是蛋白質被識別特異酶切位點的蛋白酶水解后得到的肽片段的質量圖譜。由于每種蛋白的氨基酸序列（一級結構）都不同，當蛋白被水解后，產生的肽片段序列也各不相同，因此其肽質量指紋圖也具有特征性。5、肽序列標簽（ peptide sequence tag，PST ）由一個多肽的部分氨基酸序列和該肽的質量以及該肽未測序部分的質量等組成。數據庫檢索鑒定蛋白質時，可用讀出的部分氨基酸序列，結合此段序列前后的離子質量和肽段母離子質量，在數據庫中查詢，對肽段進行鑒定。簡答題：1. 電噴霧電離原理：樣品溶解在溶劑中，溶液從毛細管流

26、出時,在電場及輔助氣流作用下噴成霧狀的帶電微液滴,在加熱氣體作用下,液滴中溶劑被蒸發,導致液滴直徑逐漸變小,表面電荷密度增加。當表面電荷產生的庫侖排斥力與液滴表面張力大致相等,液滴炸碎,產生帶電的更小微滴;這些液滴中溶劑再蒸發，重復直至樣品以離子方式從液滴表面蒸發，進入氣相。這些樣品離子通過錐孔、聚焦透鏡進入質譜儀分析器后被檢測。優點：測定分子質量高；靈敏度極高（10-15mol）；軟電離，可觀察生物分子非共價反應；易于和LC串聯，直接分析流速為1ml/min的LC洗脫液；沒有基質干擾；適于四極桿質量分析器、離子阱質量分析器做結構分析；帶多電荷，允許質量范圍窄的設備檢測高質量數的離子，通過計算

27、平均值給出更精確的質量數；特別適于測多肽的修飾；樣品前處理簡單可直接分析RP-HPLC脫鹽處理的溶液。缺點：耐鹽能力低；對某些化合物特別敏感，污染難清洗；樣品需先氣化；帶多電荷，在分析混合物時，產生混亂；定量時需內校準。2. 基質輔助激光解析電離：原理：MALDI 是將樣品均勻包埋在固體基質中，基質吸收激光提供的能量而蒸發，攜帶部分樣品分子進入氣相，并將一部分能量傳遞給樣品分子使其離子化。離子化后的分子被電場加速進入飛行時間質量分析器而被檢測。基質在MALDITOF MS的方法中的作用主要是從激光脈沖中吸收能量并使被測分子分離成單分子狀態。優點：質量數可達300,000Da；10-15 至10

28、-18級靈敏度；軟電離方式，無或極少碎片離子；耐鹽（樣品含鹽可達毫摩爾濃度）；適于分析復雜混合物。缺點：分辨率低；1000Da以下基質峰干擾；激光解吸附離子化有可能使樣品光降解；不能分析非共價鍵相互作用；定量時需要內校準；如沒有反射飛行裝置，不能分析多肽修飾。MALDI 的進樣是固相方式，不像ESI的液相進樣容易受溶液性質的影響，因此對雜質的忍耐性較好。3、3. 飛行時間質量分析器為什么加離子鏡反射？即增加了一個反射電場，起到能量聚焦作用，使質量相同能量不同的離子進入反射器后，能量大的離子速度快，但走的距離遠，能量小的離子速度慢，但走的距離近，經過反射后，二者同時到達檢測器，這樣就消除了由于能

29、量分散造成的分辨率降低；且離子改變了飛行方向，延長了飛行距離，提高分辨率和準確度。4. 串聯質譜測定多肽序列的原理：多肽碰撞誘導解離時的碎裂作用優先發生在酰胺鍵上,生成專一的序列離子。電荷保留在N端的碎片上定名為a,b,c離子；電荷保留于C端的碎片上時稱之為x,y,z離子。y、b系列相鄰離子的質量差，即為氨基酸殘基質量，根據完整或互補的y、b系列離子可推算出氨基酸的序列。第八章 蛋白質功能研究蛋白質相互作用研究策略和方法（一）生化方法GST（谷胱甘肽巰基轉移酶） pull-down assay，親和印跡，免疫共沉淀，化學交聯，熒光共振能量轉移Fluorescent Resonant Energ

30、y Transfer （FRET），表面等離子共振技術(Surface Plasmon Resonance，SPR)，生物傳感器技術（Biosensor）1.GST pull-down assay基本原理 細菌表達的谷胱甘肽s轉移酶（GST）融合蛋白主要用于蛋白的親和純化，也可以將GST融合蛋白作為探針，與溶液中的特異性搭檔蛋白結合，然后根據谷胱甘肽瓊脂糖球珠能夠沉淀GST融合蛋白的能力來確定相互作用的蛋白。一般在得到目標蛋白的抗體前，或發現抗體干擾蛋白質蛋白質之間的相互作用時，可以啟用GST沉降技術。該方法只是用于確定體外的相互作用。兩種應用： 1）確定融合（或探針）蛋白與未知（或靶）蛋白間

31、的新的相互作用 2）證實探針蛋白與已知蛋白質間可疑的相互作用 2. 親和印跡 蛋白質用PAGE膠分離后，轉移到硝酸纖維素膜上，然后用特異性的蛋白質、肽段或配體來檢測膜上的蛋白質。3. 免疫共沉淀 在細胞裂解液中加入抗興趣蛋白的抗體，孵育后再加入與抗體特異結合的固化于Agarose珠上的Protein A或G，若細胞中有與興趣蛋白結合的目的蛋白，就可以形成這樣一種復合物：“目的蛋白興趣蛋白抗興趣蛋白抗體Protein A或G”，通過離心分離，經變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，復合物又被分開。然后經免疫印跡或質譜檢測目的蛋白。4、化學交聯使用一種交聯試劑，并且在交聯試劑的光激活部分帶有標記，將該試劑耦聯到

32、一蛋白質上，耦聯體與抽提物溫育在一起。如果抽提物中的A蛋白能與耦聯蛋白質發生相互作用，用光激活后交聯劑的一部分就結合到A蛋白上。加入還原劑，切割交聯試劑，使A蛋白上帶有交聯劑上有標記的部分，然后用凝膠電泳等方法分析蛋白質。5.熒光共振能量轉移（FRET） FRET是一個無輻射、量子級能量轉移現象，它指的是當一個熒光分子（及供體）受到激發時，能量向鄰近的另一熒光基團（即受體）轉移的過程。但僅當受體和供體的距離小于10nm，且激發光譜相重疊時，FRET才能發生。并且隨著光譜重疊的增加，FRET的效率將提高，同時FRET可能發生的距離也將增加。將兩蛋白質分別使用CFP/YFP(或BFP/GFP)標記

33、，當兩者在同一細胞中表達時，只要檢測到FRET發生，則證明兩蛋白質間距離小于10nm，存在相互作用。5. 表面等離子共振技術(Surface Plasmon Resonance，SPR)當光從光密介質入射到光疏介質時（n1>n2）就會發生全反射現象，產生沿X軸方向傳播而振幅衰減的一個波，即消逝波。當消逝波與表面等離子波發生共振時，檢測到的反射光強會大幅度地減弱。能量從光子轉移到表面等離子，入射光的大部分能量被表面等離子波吸收，使得反射光的能量急劇減少。（二）分子生物學方法酵母雙雜交系統、噬菌體展示技術« 酵母雙雜交酵母雙雜交系統的建立得力于對真核細胞轉錄因子，特別是酵母轉錄因子

34、GAL 4 性質的研究。細胞起始基因轉錄需要有反式轉錄激活因子的參與。轉錄激活因子在結構上是組件式的，往往由兩個或兩個以上相互獨立的結構域構成，其中有N 端的DNA 結合結構域(DNA binding domain，簡稱為BD) 和C 端的轉錄激活結構域(activation domain，簡稱為AD) 。BD可識別DNA 上的特異序列，并使轉錄激活結構域定位于所調節的基因的上游 ；AD可同轉錄復合體的其他成分作用，啟動它所調節的基因的轉錄。當兩者獨立存在時, 無轉錄激活功能；但兩者只要相互接近, 即可激活轉錄。酵母雙雜交系統三個組成部分1 ）與BD融合的蛋白表達載體，被表達的蛋白稱誘餌蛋白（

35、bait）；2 ）與AD融合的蛋白表達載體，被其表達的蛋白稱為獵物或靶蛋白（prey）；3 ）帶有一個或多個報告基因的宿主菌株。常用的報告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等；有GAL4系統和LexA系統。酵母單雜交DNA結合蛋白（即轉錄因子）與DNA順式作用元件結合，調控報道基因的表達，研究DNA與蛋白質的相互作用。酵母三雜交主要特征：蛋白X與Y的相互作用通過第三個分子蛋白Z的參與實現目的：研究兩個蛋白質與第三個成分間的相互作用，按第三個成分的不同，可以是蛋白質、RNA 或小分 子藥物反向雙雜交反向雙雜交系統（Reverse two hybrid system）特點：反選擇篩選策略

36、原理： URA3編碼的酶是尿嘧啶合成的關鍵酶。該酶能把5-氟乳清酸(5-FOA)轉化成對細胞有毒的物質。URA3基因的啟動子內引入Gal4的結合位點。改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的選擇性培養基上，只有當“誘餌”和“獵物”相互作用激活URA3基因的表達才能生長。在含有5-FOA的完全培養基上 ，“誘餌”和“獵物”的相互作用則抑制細胞的生長。然而如果目的蛋白，即與BD或AD融合的蛋白質發生了突變或者由于外加藥物的干擾不再相互作用，URA3基因不表達，則細胞能在含有5-FOA的完全培養基上生長。« 噬菌體展示技術噬菌體展示技術能將表達的外源多肽或蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌體的表面，進而通

37、過親和富集法篩選表達有特異肽或蛋白質的噬菌體，為篩選到目的蛋白或多肽奠定了基礎。優點：直接得到基因；高選擇性篩選復雜混合物；直接評價蛋白質結合特異性原理：噬菌體展示技術是將待篩選的蛋白質插入到噬菌體信號肽序列與主要衣殼蛋白基因8 或基因3 之間，構建成融合蛋白噬菌體文庫，表達的融合蛋白呈現在噬菌體表面，被展示的多肽或蛋白可保持相對的空間結構和生物活性。每個噬菌體粒子只展示一種序列的外源肽鏈。利用目的蛋白與特定配基結合后，采用適當的淘洗方法洗去非特異結合的噬菌體，最終從噬菌體文庫中篩選出能結合靶分子的目的噬菌體；外源多肽或蛋白質與編碼遺傳信息之間提供了直接的物理聯系。該技術的顯著特點是建立了基因

38、型和表現型之間的對應關系。三個基本因素：1. 在噬菌體p和p衣殼蛋白N端插入外源待篩基因編碼的蛋白，形成的融合蛋白表達在噬菌體顆粒的表面；同時其保持的外源蛋白天然構象能被相應的抗體或受體識別。2. 利用固相支持物上的抗體或受體，采用親和篩選法（淘洗，panning），從噬菌體文庫中篩選出能結合篩選分子的目的噬菌體。3. 外源多肽或蛋白質表達在噬菌體的表面，其編碼基因可通過分泌型噬菌體的單鏈DNA 測序推導出來。噬菌體展示技術的局限性：（1 ）在噬菌體展示過程中必須經過細菌轉化、噬菌體包裝，有的展示系統還要經過跨膜分泌過程，這就大大限制了所建庫的容量和分子多樣性。目前，常用的噬菌體展示文庫中含有

39、不同序列分子的數量一般限制在109（2 ）不是所有的序列都能在噬菌體中獲得很好的表達，因為有些蛋白質功能的實現需要折疊、轉運、膜插入和絡合，導致在體內篩選時需外加選擇壓力。例如，在噬菌體展示文庫試驗中，由于部分未折疊的蛋白在細菌中很容易被降解，因此，必須小心控制條件，以保證在噬菌體表面展示的文庫沒有降解。另外，真核細胞蛋白在細菌中表達差，是因為它們的蛋白質合成與折疊機制不同的緣故。（3）噬菌體展示文庫一旦建成，很難再進行有效的體外突變和重組，進而限制了文庫中分子遺傳的多樣性。（4）由于噬菌體展示系統依賴于細胞內基因的表達，所以，一些對細胞有毒性的分子如生物毒素分子，很難得到有效表達和展示。第九

40、章蛋白質翻譯后修飾的鑒定這個章節，很可能會考，而且是論述題1、 名詞解釋：微觀不均一性：糖蛋白存在著復雜的微觀不均一性(microheterogencity)，即在蛋白質的氨基酸序列完全相同的情況下，由于糖鏈的組成或連接方式的不同而形成多種糖蛋白亞型。糖蛋白的這種復雜性在其生理功能上有其重要意義，但卻給糖蛋白的分析帶來了極大的困難。2、 N-糖苷鍵、 O-糖苷鍵N-糖苷鍵：N-糖基化通常是指糖鏈共價連接在蛋白質肽鏈上的天冬酰胺 (Asn) 殘基的酰胺基、N-末端氨基酸殘基的-氨基、賴氨酸或精氨酸殘基的-氨基處。糖鏈與天冬酰胺殘基的連接發生在三個殘基的特殊識別序列 (Asn-X-Ser/Thr，

41、其中的X為除脯氨酸和天冬氨酸以外的任何氨基酸）處。O-糖苷鍵：通常是指糖鏈通過N-乙酰葡萄糖胺連接在蛋白質的絲氨酸、蘇氨酸、羥賴氨酸或羥脯氨酸殘基側鏈的羥基處。3、磷酸化蛋白質組研究策略（大題）一、磷酸化蛋白質的檢測 1. 32P放射性標記法 2抗體免疫印跡檢測法二、磷酸化蛋白質的富集策略 富集的策略應用在磷酸化蛋白質組研究中，有兩種不同的應用階段，包括富集磷酸化蛋白質和富集磷酸化肽段。1磷酸化蛋白質的富集 磷酸化蛋白質抗體 這是目前富集磷酸化蛋白質的主要手段。 化學修飾2磷酸肽的的富集策略(1) 反相液相色譜(RP-HPLC)分離磷酸肽(2) IMAC分離富集磷酸肽 固相金屬親和色譜（imm

42、obilized metal affinity chromatography IMAC)最初用于純化含組氨酸的蛋白質，現在常被用于選擇性地富集磷酸化肽段，對磷酸化蛋白質的富集無效。 磷酸基團與固相化的金屬離子通過靜電作用吸附，可選擇性地親和提取磷酸化肽段，在堿性環境下或有磷酸鹽存在時，這種相互作用被破壞從而使磷酸化肽段被洗脫。(3) 磷酸基團親和取代三、磷酸化肽段的鑒定 1. MALDI-TOF-MS結合磷酸酶水解分析法，這是蛋白質磷酸肽鑒定的常用手段。2.串聯質譜鑒定四、磷酸化氨基酸位點的確定 要確定其磷酸化位點，需要用串聯質譜產物離子掃描模式對磷酸肽進行序列分析。五、蛋白質磷酸化的定量分析

43、(1) 15N穩定同位素標記法(2)同位素標記的親和試劑第十章 蛋白質組學定量技術名詞解釋：1、 細胞培養氨基酸穩定同位素標記（SILAC）：基本原理 分別用天然同位素(輕型、中型)或穩定同位素(重型)標記的必需氨基酸，主要是Lys和Arg，取代細胞培養基中相應氨基酸，細胞經5-6個倍增周期后，穩定同位素標記的氨基酸完全摻入到細胞新合成的蛋白質中替代了原有氨基酸。不同標記細胞的裂解蛋白按細胞數或蛋白量等比例混合，經過SDS-PAGE分離和質譜分析，通過比較一級質譜圖中三個同位素型肽段的面積大小進行相對定量，同時二級質譜圖對肽段進行序列測定從而鑒定蛋白質。（在培養基設計時，該必需氨基酸必須是添加

44、到培養基當中的。）2、 .熒光差異凝膠電泳 DIGE 簡介：2 -D DIGE是一種在2-D 電泳之前標記蛋白樣品的一種方法，可以對樣品間蛋白豐度的差異進行精確分析。有兩類提料可供選擇Cy2、Cy3、Cy5最小標記染料，以及Cy3、Cy5 飽和標記染料，它們的分子量和電荷匹配，因而標記不同CyDye DIGE 染料的同一種蛋白將遷移到2 -D膠的同一位置 。最小標記法染料 Cy2只對樣品中的少量蛋白進行了標記，因此稱為“最小標而法”，用在容易獲得多量樣品的常規2-D電泳。標記肽段中賴氨酸殘基上的氨基，都帶一價電荷，取代標記后不會改變蛋白等電點。飽和標記染料 Cy3、Cy5與蛋白半胱氨酸殘基的巰

45、基基團共價結合。用于稀少樣品標記。為了實現對半胱氨酸殘基的最大化標記，標記時采用了熒光染料相對于標記蛋白的高比率，使得每一種蛋白的所有可能的半胱氨酸都進行了標記， 導致一個樣品中蛋白質的大多數半胱氨酸基團都被標記。2-D DIGE內標：簡答題：3.同位素標記親和標簽技術Isotope-coded affinity tag（ICAT）A: ICAT試劑結構:包括3個部分，親和標簽(生物素，biotin)，用來分離ICAT標記的多肽；連接子，用來整合穩定的同位素；活性基團，用來特異結合巰基(半胱氨酸)。試劑具有兩種形式：重型（含8個氘）和輕型（含8個氫）。B: ICAT標記定量技術流程：來源不同處

46、理的蛋白質分別用重型ICAT試劑和輕型ICAT試劑專一標記Cys，標記后等量混合，胰蛋白酶酶切，親和純化得到ICAT標記的多肽，質譜分析，依據MS質譜峰圖強度進行定量，MS/MS鑒定肽段。o優勢: 1.將混合樣品(來自正常和病變細胞或組織等) 直接測試；2.快速定性和定量鑒定低豐度蛋白質、尤其是膜蛋白等疏水性蛋白等；3.快速找出重要功能蛋白質(疾病相關蛋白質) 及生物標志分子,進而快速用于疾病診斷；4.能夠兼容分析任何條件下體液、細胞、組織中絕大部分蛋白質； 5.烷化反應即使在鹽、去垢劑、穩定劑(如SDS、尿素、鹽酸胍等)存在下都可進行； 6.只需分析含Cys殘基的肽段，從而降低了蛋白質混合物分析的復雜性； 7.ICAT允許任何類型的生化、免疫、物理的分離方法，因此能很好地定量分析微量蛋白質。ICAT法的缺點： （1）它不能用于標記不含半胱氨酸