1、全國(guó)結(jié)核病學(xué)術(shù)會(huì)議全國(guó)結(jié)核病學(xué)術(shù)會(huì)議 結(jié)核病疫苗的新進(jìn)展結(jié)核病疫苗的新進(jìn)展國(guó)際公共衛(wèi)生問題國(guó)際公共衛(wèi)生問題 20世紀(jì)的中期，許多從事衛(wèi)生事業(yè)的專業(yè)世紀(jì)的中期，許多從事衛(wèi)生事業(yè)的專業(yè)人員曾經(jīng)很樂觀地認(rèn)為傳染病將在不久的人員曾經(jīng)很樂觀地認(rèn)為傳染病將在不久的將來(lái)被徹底消滅。如今，艾滋病的流行、將來(lái)被徹底消滅。如今，艾滋病的流行、肺結(jié)核、瘧疾、以及各種具有抵抗抗生素肺結(jié)核、瘧疾、以及各種具有抵抗抗生素的傳染病每年使上百萬(wàn)的人死亡。在很大的傳染病每年使上百萬(wàn)的人死亡。在很大程度上，不僅因?yàn)槿狈茖W(xué)知識(shí)使這些流程度上，不僅因?yàn)槿狈茖W(xué)知識(shí)使這些流行病得以傳播，而且承受傳染病壓力最大行病得以傳播，而且承受傳

2、染病壓力最大的貧窮國(guó)家沒有對(duì)付這些疾病的工具。的貧窮國(guó)家沒有對(duì)付這些疾病的工具。 國(guó)家衛(wèi)生部近期報(bào)告國(guó)家衛(wèi)生部近期報(bào)告n發(fā)病數(shù)居前五位的病種為：發(fā)病數(shù)居前五位的病種為： 乙型肝炎、乙型肝炎、肺結(jié)核肺結(jié)核、淋病、淋病、 痢疾、未分型病毒性肝炎。痢疾、未分型病毒性肝炎。 n死亡數(shù)居前五位的病種為：死亡數(shù)居前五位的病種為： 狂犬病、狂犬病、肺結(jié)核肺結(jié)核、乙型肝炎、乙型肝炎、 流腦、新生兒破傷風(fēng)。流腦、新生兒破傷風(fēng)。 怎么辦？怎么辦？ 在世界面臨的嚴(yán)重的結(jié)核病防治在世界面臨的嚴(yán)重的結(jié)核病防治 問題上，我們應(yīng)當(dāng)做什么？問題上，我們應(yīng)當(dāng)做什么？ 1、研究結(jié)核桿菌致病機(jī)制、研究結(jié)核桿菌致病機(jī)制 2、發(fā)現(xiàn)抗結(jié)

3、核病新藥、發(fā)現(xiàn)抗結(jié)核病新藥 3、研制抗結(jié)核病疫苗、研制抗結(jié)核病疫苗CD4CD4+ + Th1Th1或或Th2 TTh2 T淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞 與抗結(jié)核免疫反應(yīng)的關(guān)系與抗結(jié)核免疫反應(yīng)的關(guān)系 CD4 、CD8 T T細(xì)胞在清除胞內(nèi)細(xì)胞在清除胞內(nèi)感染結(jié)核桿菌中的不同途徑與效果感染結(jié)核桿菌中的不同途徑與效果引自Silva CL, FEMS Microbiology Letters, 2001; 197: 11CD4+CD8+ 結(jié)核病疫苗的新進(jìn)展 ( (一一) ) 減毒疫苗減毒疫苗 ( (二) ) 重組疫苗重組疫苗 ( (三) ) 亞單位疫苗亞單位疫苗 ( (四) DNA) DNA疫苗疫苗 ( (五) )

4、 治療性疫苗治療性疫苗Orme IM. 2001美國(guó)美國(guó)NIHNIH結(jié)核疫苗研究項(xiàng)目概況結(jié)核疫苗研究項(xiàng)目概況 1. 1. 牛型分枝桿菌減毒活疫苗牛型分枝桿菌減毒活疫苗BCGBCG。2. 2. 田鼠分枝桿菌減毒活疫苗。田鼠分枝桿菌減毒活疫苗。 自然突變株，保護(hù)力和自然突變株，保護(hù)力和BCGBCG相當(dāng)。相當(dāng)。 已應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)。已應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)。3. 3. 通過基因敲除通過基因敲除/ /突變?nèi)诵徒Y(jié)核桿菌突變?nèi)诵徒Y(jié)核桿菌 毒力基因，構(gòu)建結(jié)核桿菌減毒毒力基因，構(gòu)建結(jié)核桿菌減毒 活疫苗。活疫苗。 （一）減毒活疫苗（一）減毒活疫苗 1. 1.減毒活疫苗減毒活疫苗BCGBCG 近80年歷史的減毒活疫苗BCG

5、是目前僅有的預(yù)防結(jié)核病的疫苗。BCG來(lái)源于傳代 230代的牛分枝桿菌，一直被廣泛用作預(yù)防結(jié)核病的疫苗，但多年的應(yīng)用發(fā)現(xiàn)BCG的兩大特性: 1、極不穩(wěn)定，地域性極強(qiáng)，保護(hù)效果從高達(dá) 80%至某些地域的0%，有時(shí)甚至帶來(lái)有害效果; 2、BCG通常可有效保護(hù)新生兒及兒童免患初期疾病如結(jié)核性腦膜炎，而對(duì)青少年及成人幾乎不能提供阻止后期感染性肺結(jié)核發(fā)生的保護(hù)力。BCG似為一雙刃劍，有時(shí)保護(hù)，而有時(shí)毫無(wú)用處甚至有害。因此，BCG的免疫病理和毒力問題仍待謹(jǐn)慎的研究和探討。卡介苗免疫保護(hù)效果卡介苗免疫保護(hù)效果 BCGBCG保護(hù)作用差異大的原因保護(hù)作用差異大的原因nBCG丟失了一些結(jié)核桿菌特異性抗原；丟失了一些

6、結(jié)核桿菌特異性抗原；n環(huán)境分枝桿菌的作用，使環(huán)境分枝桿菌的作用，使BCG在體內(nèi)受在體內(nèi)受到抑制，不能引起有效的免疫保護(hù)作用；到抑制，不能引起有效的免疫保護(hù)作用；nBCG株、劑量和接種方案存在差異；株、劑量和接種方案存在差異；n人群基因差異；人群基因差異；n結(jié)核桿菌基因差異。結(jié)核桿菌基因差異。BCGBCG所缺失的結(jié)核桿菌特異性基因組區(qū)域所缺失的結(jié)核桿菌特異性基因組區(qū)域引自Mustafa AS. Molecular Immunology, 2002; 39:113環(huán)境分枝桿菌感染使環(huán)境分枝桿菌感染使BCGBCG失去免疫保護(hù)作用失去免疫保護(hù)作用引自Agger EM. Vaccine, 2002; 2

7、1:7( (二) ) 重組疫苗重組疫苗n安全的載體：以安全的載體：以BCG為表達(dá)載體。為表達(dá)載體。n人型結(jié)核桿菌保護(hù)性抗原：人型結(jié)核桿菌保護(hù)性抗原： Ag85B 和和 ESAT-6，MPT64 等。等。n增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子：增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子： IFN-r, IL-2, IL-12, G-CSF等。等。構(gòu)建重組構(gòu)建重組BCGBCG疫苗示意圖疫苗示意圖重組重組MtbMtb RD1-2F9 RD1-2F9（含（含ESAT-6ESAT-6基因）基因）BCGBCG疫苗免疫保護(hù)力增強(qiáng)疫苗免疫保護(hù)力增強(qiáng)- -體重變化體重變化重組重組BCGBCG免疫保護(hù)力比較免疫保護(hù)力比較salineBCG

8、BCG:RD1-2F9重組重組Mtb RD1-2F9 BCG疫苗免疫保疫苗免疫保護(hù)活性增強(qiáng)護(hù)活性增強(qiáng)細(xì)菌清除率改變細(xì)菌清除率改變salineBCGBCG:RD1-2F9saline BCG BCG:RD1-2F9重組重組MtbMtb RD1-2F9 BCG RD1-2F9 BCG疫苗免疫保護(hù)活疫苗免疫保護(hù)活性增強(qiáng)性增強(qiáng)脾臟組織觀察脾臟組織觀察引自Pym AS. Nature Medicine, 2003; 9: 533重組重組MtbMtb Ag85B BCG Ag85B BCG疫苗疫苗(rBCG30) (rBCG30) 免疫活性增強(qiáng)免疫活性增強(qiáng)DTHDTH反應(yīng)增強(qiáng)反應(yīng)增強(qiáng)引自Horwitz M

9、A. PNAS, 2000; 97(25):13853rBCG30rBCG30免疫保護(hù)性增強(qiáng)免疫保護(hù)性增強(qiáng)體重變化體重變化rBCG30 rBCG30 免疫免疫保護(hù)性增強(qiáng)保護(hù)性增強(qiáng)肺臟和肝臟組肺臟和肝臟組織學(xué)觀察織學(xué)觀察2.2 2.2 重組痘苗病毒疫苗重組痘苗病毒疫苗n痘苗病毒疫苗也是一安全的載體。n將結(jié)核桿菌抗原Ag85和組織纖維蛋白溶酶原激活因子（tPA)信號(hào)肽基因拼接后，導(dǎo)入痘苗病毒載體，形成重組痘苗疫苗，可以高效表達(dá)Ag85。用該疫苗免疫小鼠，可以刺激針對(duì)結(jié)核菌的保護(hù)性免疫反應(yīng)（IL-2、IFN-升高）。表達(dá)表達(dá)MtbMtb Ag85 Ag85復(fù)合體的痘苗病毒免疫反應(yīng)復(fù)合體的痘苗病毒免疫

10、反應(yīng) 引自Malin AS. Microbes and Infection. 2000; 2:1677表達(dá)表達(dá)MtbMtb Ag85 Ag85復(fù)合體的痘苗病毒免疫反應(yīng)復(fù)合體的痘苗病毒免疫反應(yīng) 2.3 2.3 重組沙門氏菌疫苗重組沙門氏菌疫苗 以鼠傷寒桿菌（Salmonella typhimurium)為載體，導(dǎo)入融合的結(jié)核桿菌Ag85B基因和HlyB 基因（轉(zhuǎn)運(yùn) Ag85B蛋白出胞外），可得到能夠分泌表達(dá) Ag85B 融合蛋白的重組活疫苗。口服該疫苗免疫小鼠，明顯增高了IFN-和 TNF-的生成，并且在一定時(shí)期內(nèi)具有和BCG相當(dāng)?shù)拿庖弑Ｗo(hù)能力。重組重組Mtb Ag85B鼠傷寒桿菌疫苗鼠傷寒桿菌

11、疫苗 免疫反應(yīng)性觀察免疫反應(yīng)性觀察細(xì)胞因子變化細(xì)胞因子變化引自引自FEMS Immunology and Medical Microbiology FEMS Immunology and Medical Microbiology 2000,27:283-2682000,27:283-268重組重組Mtb Ag85B鼠傷寒桿菌疫苗鼠傷寒桿菌疫苗 免疫效應(yīng)觀察免疫效應(yīng)觀察保護(hù)力比較保護(hù)力比較2.4 2.4 重組重組BCGBCG多價(jià)疫苗多價(jià)疫苗國(guó)內(nèi)在重組國(guó)內(nèi)在重組BCGBCG方面的研究方面的研究1 1、復(fù)旦大學(xué)王洪海：、復(fù)旦大學(xué)王洪海：IFN-+ Ag85B+ ESAT-6 IFN-+ Ag85B+

12、 ESAT-6 2 2、第四軍醫(yī)大學(xué)徐志凱：、第四軍醫(yī)大學(xué)徐志凱：IL-2+Ag85B+ESAT-6IL-2+Ag85B+ESAT-63 3、四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)院鮑朗：、四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)院鮑朗： ESAT-6ESAT-6 Infect. Immun. 2003, 71(4):1656 Infect. Immun. 2003, 71(4):16564 4、華中理工大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院皇甫永穆：、華中理工大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院皇甫永穆： HSP65HSP65 J Huazhong Univ Sci Technolog J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. Med Sci.

13、2004;24(2) 2004;24(2) 表達(dá)載體的構(gòu)建表達(dá)載體的構(gòu)建連接連接酶切酶切BCGPPPESAT 融合基因在融合基因在E.coli中的表達(dá)中的表達(dá) (1) 攜帶人IFN -Ag85B融合基因在 原核細(xì)胞中的表達(dá) (2) 攜帶人IFN -ESAT-6融合基因在 原核細(xì)胞中的表達(dá) (3) 攜帶人IFN-Ag85B-ESAT-6 融合 基因的原核表達(dá)（三）亞單位疫苗（三）亞單位疫苗n結(jié)核桿菌培養(yǎng)基濾過蛋白（CFP）一定程度上具有保護(hù)小鼠感染結(jié)核的能力，這促使人們開始研究有效的亞單位疫苗。人們?cè)谠缙谂囵B(yǎng)濾液中發(fā)現(xiàn)具有明顯免疫原性的蛋白質(zhì)：Ag85復(fù)合體和ESAT-6。二者分別具有免疫保護(hù)作

14、用，當(dāng)二者融合表達(dá)則時(shí)保護(hù)力更強(qiáng)，可達(dá)到和BCG相當(dāng)?shù)乃健克隆分泌蛋白Mtb8.4,并通過與T細(xì)胞相互作用分析發(fā)現(xiàn)它可被T細(xì)胞識(shí)別，免疫動(dòng)物證明它具有很強(qiáng)的免疫活性。30kD30kD分泌蛋白分泌蛋白(Ag85)(Ag85)的免疫原性的免疫原性T T細(xì)胞增殖反應(yīng)細(xì)胞增殖反應(yīng)引自引自SinhaSinha RK. Vaccine, 1997; 15: 689 RK. Vaccine, 1997; 15: 689亞單位疫苗的特點(diǎn)亞單位疫苗的特點(diǎn)n環(huán)境分枝桿菌存在使BCG的預(yù)防保護(hù)作用大為降低，此時(shí)亞單位疫苗具有較好的免疫保護(hù)力。n免疫佐劑和細(xì)胞因子對(duì)疫苗的效應(yīng)影響很大。nT細(xì)胞表位對(duì)于亞單位疫苗非

15、常關(guān)鍵。疫苗通過特異性表位和特異性的T細(xì)胞作用，分別激活Th1和CTL。n可以作為治療性疫苗。引自引自Mustafa AS. Molecular Immunology, 2002; 39:113T T細(xì)胞表位細(xì)胞表位利用后基因組學(xué)尋找亞單位疫苗利用后基因組學(xué)尋找亞單位疫苗 基因免疫基因免疫 (Genetic immunization)，又稱遺傳，又稱遺傳免疫，或者叫做免疫，或者叫做DNA疫苗疫苗(DNA Vaccine)，是九十年，是九十年代發(fā)展起來(lái)的一種嶄新的免疫接種技術(shù)。是繼巴斯德代發(fā)展起來(lái)的一種嶄新的免疫接種技術(shù)。是繼巴斯德 開創(chuàng)的減毒疫苗，基因工程疫苗之后的第三代疫苗。開創(chuàng)的減毒疫苗，

16、基因工程疫苗之后的第三代疫苗。基因免疫的主要原理是將抗原編碼基因插入帶有強(qiáng)啟基因免疫的主要原理是將抗原編碼基因插入帶有強(qiáng)啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體，然后用物理方法將此重組質(zhì)粒導(dǎo)入動(dòng)子的質(zhì)粒載體，然后用物理方法將此重組質(zhì)粒導(dǎo)入體內(nèi)細(xì)胞，抗原編碼基因即在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)合成抗原蛋體內(nèi)細(xì)胞，抗原編碼基因即在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)合成抗原蛋白，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)白，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)。 DNA疫苗的組成：一般由病原體抗原疫苗的組成：一般由病原體抗原 編碼基因和作為真核表達(dá)載體的質(zhì)粒構(gòu)成。編碼基因和作為真核表達(dá)載體的質(zhì)粒構(gòu)成。 編碼基因：編碼基因： 完整的一組基因；完整的一組基因； 單個(gè)基因的單個(gè)基因的cDNA；

17、抗原決定簇的一段基因。抗原決定簇的一段基因。 總之表達(dá)產(chǎn)物為病原體有效抗原成分。總之表達(dá)產(chǎn)物為病原體有效抗原成分。 （1）直接轉(zhuǎn)入）直接轉(zhuǎn)入DNA，包括開放讀框，適當(dāng)?shù)恼婧耍ㄩ_放讀框，適當(dāng)?shù)恼婧宿D(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控因子，可以體內(nèi)合成蛋白質(zhì)，其折疊轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控因子，可以體內(nèi)合成蛋白質(zhì)，其折疊和翻譯后修飾在大多數(shù)情況下和普通感染類似，模擬和翻譯后修飾在大多數(shù)情況下和普通感染類似，模擬病毒感染的體內(nèi)蛋白質(zhì)合成進(jìn)入病毒感染的體內(nèi)蛋白質(zhì)合成進(jìn)入MHCI途徑，也可途徑，也可以由以由APC識(shí)別進(jìn)入識(shí)別進(jìn)入MHCII途徑，這樣細(xì)胞免疫和體途徑，這樣細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)都調(diào)動(dòng)起來(lái)，可誘發(fā)持久的免疫應(yīng)答。液免疫

18、反應(yīng)都調(diào)動(dòng)起來(lái)，可誘發(fā)持久的免疫應(yīng)答。 （2）由于轉(zhuǎn)入）由于轉(zhuǎn)入DNA本身缺乏復(fù)制機(jī)制，不會(huì)與宿本身缺乏復(fù)制機(jī)制，不會(huì)與宿主染色體基因整合，所以不會(huì)象減毒疫苗出現(xiàn)毒力恢主染色體基因整合，所以不會(huì)象減毒疫苗出現(xiàn)毒力恢復(fù)的可能性。復(fù)的可能性。 （3）構(gòu)建）構(gòu)建DNA疫苗載體相對(duì)容易，而成疫苗載體相對(duì)容易，而成熟的質(zhì)粒熟的質(zhì)粒DNA純化技術(shù)能夠加快和簡(jiǎn)化發(fā)展純化技術(shù)能夠加快和簡(jiǎn)化發(fā)展新疫苗的進(jìn)展，并可提供廣譜的疫苗。新疫苗的進(jìn)展，并可提供廣譜的疫苗。 （4）DNA疫苗的制備成本低于基因工程疫苗的制備成本低于基因工程重組疫苗，可以免去生產(chǎn)和純化蛋白質(zhì)的大重組疫苗，可以免去生產(chǎn)和純化蛋白質(zhì)的大量費(fèi)用，制

19、備起來(lái)省時(shí)省力。量費(fèi)用，制備起來(lái)省時(shí)省力。 Krieg發(fā)現(xiàn)細(xì)菌發(fā)現(xiàn)細(xì)菌DNA能夠誘導(dǎo)非特異性的能夠誘導(dǎo)非特異性的免疫反應(yīng)，而脊椎動(dòng)物的免疫反應(yīng)，而脊椎動(dòng)物的DNA卻不能。研究卻不能。研究發(fā)現(xiàn)在這兩個(gè)基因組內(nèi)主要是未甲基化發(fā)現(xiàn)在這兩個(gè)基因組內(nèi)主要是未甲基化 胞嘧胞嘧啶磷酸鳥嘌呤（啶磷酸鳥嘌呤（unmethylated cytosine-phosphate-guanine, CpG 免疫刺激序列）二核苷出現(xiàn)的頻率不同。免疫刺激序列）二核苷出現(xiàn)的頻率不同。 Ag85 復(fù)合體復(fù)合體DNA疫苗的免疫反應(yīng)性疫苗的免疫反應(yīng)性引自引自LozesLozes E, Vaccine, 1997; 15: 830(

20、E, Vaccine, 1997; 15: 830(下同）下同）Ag85Ag85免疫保護(hù)性免疫保護(hù)性提高提高DNADNA疫苗效果的方法疫苗效果的方法n使用免疫佐劑n細(xì)胞因子應(yīng)用nDNA疫苗聯(lián)合使用nDNA疫苗和亞單位疫苗、BCG等結(jié)合使用HSP65DNAHSP65DNA疫苗疫苗/TDM(trehalose dimicolate/TDM(trehalose dimicolate) )微球體增強(qiáng)免疫效果微球體增強(qiáng)免疫效果 抗體滴度變化抗體滴度變化引自Lina KM, Gene therapy, 2003; 10: 678（下同）肺細(xì)胞再次受肺細(xì)胞再次受MtbMtb攻擊時(shí)，攻擊時(shí)，IFN-IFN-分

21、泌差異分泌差異HSP65 DNAHSP65 DNA疫苗疫苗/TDM/TDM微球體輔助增微球體輔助增強(qiáng)免疫效果強(qiáng)免疫效果細(xì)胞因子變化細(xì)胞因子變化細(xì)胞因子促進(jìn)疫苗保護(hù)作用細(xì)胞因子促進(jìn)疫苗保護(hù)作用IL-12和和IL-18對(duì)對(duì)Ag85B DNA疫苗保護(hù)力的影響疫苗保護(hù)力的影響引自引自TriccasTriccas JA. Immunology and Cell Biology, 2002; 80:346 JA. Immunology and Cell Biology, 2002; 80:346細(xì)胞因子細(xì)胞因子GM-CSFGM-CSF和和IL-12,15,18IL-12,15,18對(duì)對(duì)HSP65 DNAH

22、SP65 DNA疫苗的免疫增強(qiáng)作用疫苗的免疫增強(qiáng)作用引自引自Baek KM. Vaccine, 2003; 21:3684（下同）（下同）細(xì)胞因子細(xì)胞因子GM-CSF和和IL-12增強(qiáng)增強(qiáng) HSP65 HSP65 的免疫保護(hù)作用的免疫保護(hù)作用DNADNA疫苗聯(lián)合使用提高保護(hù)效果疫苗聯(lián)合使用提高保護(hù)效果DNADNA亞單位疫苗聯(lián)合使用亞單位疫苗聯(lián)合使用增強(qiáng)免疫效果增強(qiáng)免疫效果HSP65 DNAHSP65 DNA疫苗免疫動(dòng)疫苗免疫動(dòng)物（牛）后，物（牛）后，再用重組再用重組HSP65HSP65蛋白蛋白來(lái)增強(qiáng)免疫來(lái)增強(qiáng)免疫效果效果引自Vordermeier HM. Veterinary Microbio

23、logy, 2003; 93: 349DNADNA疫苗疫苗-BCG-BCG聯(lián)合使用策略聯(lián)合使用策略預(yù)先用Ag85 DNA疫苗免疫小鼠，可以增強(qiáng)BCG的保護(hù)效果引自Britton WJ. Immunology and Cell Biology, 2003; 81:34國(guó)內(nèi)在國(guó)內(nèi)在DNADNA疫苗方面的研究疫苗方面的研究1 1、北京、北京309309醫(yī)院吳雪瓊等：醫(yī)院吳雪瓊等： （）（）MPT64 DNAMPT64 DNA疫苗（軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)疫苗（軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào),2001,2001） （）（）Ag85A DNA Ag85A DNA 疫苗（中國(guó)免疫學(xué)雜志疫苗（中國(guó)免疫學(xué)雜志,2002,2002）

24、2 2、山東省醫(yī)科院田志剛等：、山東省醫(yī)科院田志剛等：Ag85B DNA Ag85B DNA 疫苗疫苗 （中國(guó)免疫學(xué)雜志（中國(guó)免疫學(xué)雜志,2001,2001）3 3、重慶醫(yī)科大學(xué)朱道銀等：、重慶醫(yī)科大學(xué)朱道銀等： Ag85B-MPT64 Ag85B-MPT64 融合基因融合基因 疫苗（中華結(jié)核和呼吸雜志，疫苗（中華結(jié)核和呼吸雜志，20032003）4 4、第二軍醫(yī)大學(xué)孫樹漢等：、第二軍醫(yī)大學(xué)孫樹漢等：ESAT-6 DNA ESAT-6 DNA 疫苗疫苗 （Vaccine,2004Vaccine,2004）5 5、華西醫(yī)科大學(xué)鮑朗等：、華西醫(yī)科大學(xué)鮑朗等： Ag85A DNA Ag85A DNA

25、 疫苗疫苗 （免疫學(xué)雜志（免疫學(xué)雜志20032003）（五）結(jié)核病的治療性疫苗（五）結(jié)核病的治療性疫苗 結(jié)核病的問題在有了卡介苗結(jié)核病的問題在有了卡介苗(BCG)和特和特效抗生素以后曾被長(zhǎng)期忽視，現(xiàn)在隨著效抗生素以后曾被長(zhǎng)期忽視，現(xiàn)在隨著AIDS的全球侵襲而卷土重來(lái)，再次成為疾的全球侵襲而卷土重來(lái)，再次成為疾病和死亡的首要原因之一。世界衛(wèi)生組織病和死亡的首要原因之一。世界衛(wèi)生組織已宣布結(jié)核為已宣布結(jié)核為 全球性急癥全球性急癥，但其年感染，但其年感染率仍在攀升。缺乏一種適用于所有地區(qū)的率仍在攀升。缺乏一種適用于所有地區(qū)的高效預(yù)防性疫苗是結(jié)核失控的原因之一，高效預(yù)防性疫苗是結(jié)核失控的原因之一，而更

26、關(guān)鍵的原因在于缺乏適用于大量已感而更關(guān)鍵的原因在于缺乏適用于大量已感染結(jié)核桿菌的結(jié)核患者的治療性疫苗及藥染結(jié)核桿菌的結(jié)核患者的治療性疫苗及藥物，使患者由初期感染發(fā)展為可傳播的結(jié)物，使患者由初期感染發(fā)展為可傳播的結(jié)核性疾病。核性疾病。研究治療性疫苗的必要性研究治療性疫苗的必要性 由于抗菌藥物濫用，由于抗菌藥物濫用， 產(chǎn)生嚴(yán)重危害，產(chǎn)生嚴(yán)重危害， 出現(xiàn)結(jié)核桿菌的耐藥性。目前，全球已有出現(xiàn)結(jié)核桿菌的耐藥性。目前，全球已有 17億人感染了結(jié)核桿菌，約有億人感染了結(jié)核桿菌，約有 2千萬(wàn)結(jié)核千萬(wàn)結(jié)核 病人。現(xiàn)在每年新增加病例病人。現(xiàn)在每年新增加病例 800萬(wàn)，死于萬(wàn)，死于 結(jié)核病的達(dá)結(jié)核病的達(dá)300人，高

27、居傳染病死亡人數(shù)人，高居傳染病死亡人數(shù) 之首。之首。HIV/M.tb 的雙重感染使得重大傳的雙重感染使得重大傳 染病的防治雪上加霜。因此需要開發(fā)新的染病的防治雪上加霜。因此需要開發(fā)新的 藥物和治療性疫苗。藥物和治療性疫苗。 結(jié)核治療性疫苗的試驗(yàn)結(jié)核治療性疫苗的試驗(yàn)1 1、熱滅活分枝桿菌疫苗免疫或聯(lián)合、熱滅活分枝桿菌疫苗免疫或聯(lián)合 激素藥物的治療性試驗(yàn)激素藥物的治療性試驗(yàn)2 2、多肽疫苗的治療性試驗(yàn)、多肽疫苗的治療性試驗(yàn)3 3、基因疫苗的治療性研究、基因疫苗的治療性研究4 4、其他形式的結(jié)核治療性疫苗、其他形式的結(jié)核治療性疫苗5.1 5.1 熱滅活分枝桿菌激素藥物熱滅活分枝桿菌激素藥物 肺結(jié)核在

28、肺結(jié)核在BALB/c小鼠模型中的建立促進(jìn)了結(jié)核小鼠模型中的建立促進(jìn)了結(jié)核治療性疫苗的試驗(yàn)研究。治療性疫苗的試驗(yàn)研究。Hernandez-Pando等以等以結(jié)核桿菌結(jié)核桿菌H37Rv經(jīng)氣管感染經(jīng)氣管感染BALB/c小鼠，初期出小鼠，初期出現(xiàn)以分泌現(xiàn)以分泌Th1細(xì)胞因子、細(xì)胞因子、TNF-a和和IL-1為特征的抗為特征的抗感染癥狀，感染癥狀，60天左右時(shí)則發(fā)展為天左右時(shí)則發(fā)展為TNF-a和和IL-1消消失、失、IL-4分泌增高的進(jìn)行性肺炎癥狀，此時(shí)及分泌增高的進(jìn)行性肺炎癥狀，此時(shí)及90天時(shí)，給予熱滅活分枝桿菌疫苗天時(shí)，給予熱滅活分枝桿菌疫苗2次免疫或聯(lián)合一次免疫或聯(lián)合一激素藥物激素藥物17-B-雄

29、烯二醇雄烯二醇(AED)注射，結(jié)果該疫苗注射，結(jié)果該疫苗可使小鼠重新表達(dá)可使小鼠重新表達(dá)Th1細(xì)胞因子細(xì)胞因子TNF-a和和IL-la，并使肺炎轉(zhuǎn)化為肉芽腫，達(dá)到與并使肺炎轉(zhuǎn)化為肉芽腫，達(dá)到與AED相似的效果，相似的效果，但二者無(wú)協(xié)同作用。但二者無(wú)協(xié)同作用。 5.2 5.2 多肽疫苗的治療試驗(yàn)多肽疫苗的治療試驗(yàn) 利用多肽疫苗激活細(xì)胞免疫，尤其是CD8+ CTL的活性，有助于結(jié)核桿菌的徹底清除。 0lsen等在該BALB/c小鼠肺炎模型中測(cè)試了多肽疫苗的治療效果。將來(lái)自結(jié)核桿菌培養(yǎng)物早期分泌性蛋白質(zhì)中的相對(duì)分子質(zhì)量6x103 (ESAT-6)的兩種多肽1-20和51-70以dimenthyl d

30、ioctadecylam-monium bromide/單磷酰脂A/IL-2混合物乳化后免疫經(jīng)血管或氣霧劑致肺炎的小鼠，發(fā)現(xiàn)ESAT-6的5170多肽疫苗可誘生細(xì)胞免疫應(yīng)答，免疫保護(hù)小鼠，其效果近于ESAT-6蛋白輔以BCG的免疫效果。5.3 DNA5.3 DNA疫苗的治療性研究疫苗的治療性研究 DNA疫苗是發(fā)展治療性結(jié)核疫苗的極具疫苗是發(fā)展治療性結(jié)核疫苗的極具吸引力的一項(xiàng)新技術(shù)，許多研究已顯示吸引力的一項(xiàng)新技術(shù)，許多研究已顯示DNA疫苗具強(qiáng)有力的保護(hù)作用。疫苗具強(qiáng)有力的保護(hù)作用。Morris 等以結(jié)核等以結(jié)核菌菌MPT-63和和MPT-83抗原構(gòu)建的抗原構(gòu)建的DNA疫苗，疫苗，可提供小鼠對(duì)可

31、提供小鼠對(duì)Erdman結(jié)核桿菌的免疫保護(hù)力結(jié)核桿菌的免疫保護(hù)力;而多價(jià)而多價(jià)ESAT-6、 MPT-64、MPT-63和和KatG DNA疫苗聯(lián)合免疫可誘生分別針對(duì)疫苗聯(lián)合免疫可誘生分別針對(duì)4種結(jié)核抗種結(jié)核抗原的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，而且可達(dá)到原的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，而且可達(dá)到BCG活活疫苗的保護(hù)效果。疫苗的保護(hù)效果。 DNADNA疫苗的治療效果疫苗的治療效果 1999年的年的自然自然雜志載文介紹，雜志載文介紹，感染了結(jié)核感染了結(jié)核 病的小鼠在接受結(jié)核病的小鼠在接受結(jié)核DNA疫苗注射后，其體內(nèi)原本軟弱無(wú)效的免疫苗注射后，其體內(nèi)原本軟弱無(wú)效的免疫反應(yīng)會(huì)大大加強(qiáng)，并會(huì)通過有效刺激疫反應(yīng)會(huì)大大加強(qiáng)，并

32、會(huì)通過有效刺激T細(xì)胞而獲得殺滅結(jié)核桿菌的能力。這細(xì)胞而獲得殺滅結(jié)核桿菌的能力。這項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)，項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)，DNA疫苗可消滅某些具疫苗可消滅某些具有抗藥性的結(jié)核桿菌。有抗藥性的結(jié)核桿菌。HSP65 DNAHSP65 DNA疫苗治療結(jié)核潛伏感染疫苗治療結(jié)核潛伏感染引自引自Lovvie DB. Nature, 1999; 400: 269HSP65 DNAHSP65 DNA疫苗治療結(jié)核潛伏感染疫苗治療結(jié)核潛伏感染Ag85A DNAAg85A DNA疫苗結(jié)合化學(xué)療法疫苗結(jié)合化學(xué)療法治療結(jié)核潛伏感染治療結(jié)核潛伏感染引自引自Ha SJ. Gene Therapy, 2003; 10: 1592Ag85A DNAAg85A DNA疫苗結(jié)合化學(xué)療法治療疫苗結(jié)合化學(xué)療法治療結(jié)核潛伏感染結(jié)核潛伏感染治療效果觀察治療效果觀察M. tb. H37Rv c.f.u. (log10) 5.4 5.4 其他形式的結(jié)核治療性疫苗其他形式的結(jié)核治療性疫苗 重組疫苗、營(yíng)養(yǎng)缺陷疫苗、亞單位重組疫苗、營(yíng)養(yǎng)缺陷疫苗、亞單位疫苗等也是結(jié)核治療性疫苗研制的熱疫苗等也是結(jié)核治療性