1、淀粉樣前體蛋白裂解酶特異性小干擾RNA真核表達載體的構建和鑒定作者：董煒疆，胡海濤，馮改豐，楊廣笑，王全穎 【關鍵詞】  干擾性小RNA摘要：目的構建淀粉樣前體蛋白裂解酶(BACE)特異性小干擾RNA真核表達載體。方法用PCR 擴增BACE特異性小干擾RNA，轉入帶有增強型綠熒光蛋白(EGFP)和啟動子U6的pUC19質粒，再將重組基因片段導入逆轉錄病毒真核表達載體pLXSN中，通過限制性酶切對該重組表達載體進行鑒定。結果 成功構建了BACE真核表達載體pLXSN/EGFPU6siBACE。結論pLXSN/EGFPU6siBACE載體的成功構建對進一步利用基因干擾技術治療阿爾茨海默病

2、的研究奠定了重要的基礎。關鍵詞：干擾性小RNA；阿爾茨海默病；淀粉樣蛋白分泌酶Construction and identification of eukaryotic expression vector of small interfering RNA specific for BACEDong Weijiang, Hu Haitao, Feng Gaifeng, Yang Guangxiao, Wang Quanying(1. Department of Anatomy and Histology & Embryology, Medical School of  Xian

3、 Jiaotong University, Xian 710061; 2. Xian Huaguang Biological Engenier Ld Company, Xian 710065, China)ABSTRACT：Objective To construct eukaryotic expression vector of siRNA specific for site APP cleaving enzyme(BACE). Methods The BACE targeting siRNA gene was amplified with PCR. The PCR product was

4、inserted into the pUC19/EGFPU6 plasmid. Then the pUC19/EGFPU6siBACE was digested with restriction enzyme, and the retrieved EGFPU6siBACE fragment was subcloned into retrovirus shuttle plasmid pLXSN. Which was then named pLXSN/EGFPU6siBACE. ResultsThe eukaryotic expression vector of small interfering

5、 RNA(siRNA) specific for site APP cleaving enzyme was successfully constructed. Conclusion  Construction of the siRNA targeting site APP cleaving enzyme lays the important foundation for using siRNA to prevent the Alzheimers disease. KEY WORDS: siRNA; the Alzheimers disease; site APP cleaving e

6、nzyme阿爾茨海默病(Alzheimers disease, AD) 是嚴重的中樞神經系統疾病之一,患者由于神經細胞的大量死亡而逐漸出現記憶能力、語言能力和知覺能力全面下降,最終會因腦衰竭而死亡。老年斑(senile plaque, SP) 是阿爾茨海默病的主要病理特征之一。淀粉級聯學說認為老年斑的核心成分淀粉樣肽(amyloid peptide, A)是AD發生的主要原因 1。A是淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP) 經淀粉樣前體蛋白裂解酶(site APP cleaving enzyme, BACE)和分泌酶裂解產生的。目前減少A產生的許多方法中

7、，最便捷的就是直接抑制BACE來減少A的生成。因此，抑制BACE成為設計治療AD 藥物的重要靶標，受到人們的廣泛關注。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是生物界一種古老而且高度保守的現象，是基因轉錄后沉默作用(PTGS) 的重要機制之一。RNAi主要通過核酸酶將雙鏈RNA(dsRNA)切割成2125nt的干擾性小RNA，即siRNA(small interfering RNA或short interfering RNA)，由siRNA介導識別并靶向切割同源性靶mRNA分子而實現2,3。本研究構建針對A產生的關鍵限速酶BACE的特異性小干擾RNA真核表達載體。這一工作將為

8、抑制BACE、減少或降低A產量、消除對神經元的毒性作用打下基礎，為進一步研究siRNA的作用、探索BACE對A產生的影響、尋求預防和治療阿爾茨海默病的有效措施奠定了重要的基礎。1材料與方法1.1材料               重組pUC19/EGFPU6 質粒、大腸桿菌E.coli DH5由華廣生物工程公司提供。各種限制性內切酶、T4連接酶、T4 DNA聚合酶、Taq酶、DNA片段純化試劑盒為Gibco公司產品。編碼針對分泌酶的siRNA的寡聚DNA 由

9、北京三博遠志生物技術有限公司合成。1.2方法1.2.1BACE特異性小干擾RNA的設計               從GenBank獲取人BACE mRNA全序列(GenBank Accession#: NM012104)。根據RNA設計原則，尋找干擾RNA的靶序列：從起始密碼后75個堿基開始尋找AA+N19+UU序列或AA+N19序列(N19為任意19個mRNA核苷酸序列)；計算序列中G+C含量占50%左右；該序列用Blast搜尋EST基因庫，確認所靶向

10、的基因是唯一的，為BACE特異性，不抑制其他基因的表達，且該部位不存在堿基多態性。最后將序列5 TGGACTGCAAGGA GTACAA3確定為RNAi的靶序列。全長發夾結構DNA序列的設計：向上述序列中加入loop區、反向互補序列、轉錄終止子,以便轉錄獲得shRNA；兩端加入Sal、Hind及Xho酶切位點及保護堿基，便于克隆的片段插入載體；最后得到BACE siRNA的DNA全長序列如下：CGTCGACTGGACTGCAAGGAGTACAATTCAAGAGATTGTACTCCTTGCAGTCCATTTTTCTCGAGAAGCTTG引物序列為：正向引物：5C GTCGACT GGACTGCA

11、AGGSal酶切位點AGTACAATTCAAGAGATTGTAC互補序列3負向引物：5CAAGCTTHind酶切位點CTCGAGXho酶切位點AAAATGGACTGCAAGGAGTACAATCTC互補序列3兩個引物之間有10bp的互補區。Sal、Hind酶切位點便于實現PCR產物克隆于其他載體，Xho酶切位點便于產物的克隆以及插入小片段的重組陽性克隆的酶切鑒定。1.2.2PCR擴增BACE siRNA的全長DNA序列               加入正、負

12、鏈引物各2L，dNTP(10mmol/L)2L，10×PCR緩沖液10L，TaqDNA聚合酶(10U/L)1L，去離子水83L，反應總體積100L，進行PCR反應。PCR反應條件：94預變性5min ，94變性60s，37退火60s，72延伸60s，共30個循環。72延伸5min。PCR 反應物瓊脂糖凝膠電泳，試劑盒回收PCR 產物，與pGEMT Easy載體連接，轉化E.coli DH5感受態細菌，藍白斑篩選，挑選單個菌落作內切酶分析，選出正確的克隆，序列測定采用雙脫氧鏈末端中止法，以ABI 377 DNA 自動序列測定儀進行。測序正確的質粒記為pGEMT/siRNA。1.2.3p

13、UC19/EGFPU6siBACE重組質粒的構建               用Sal、Hind雙酶切pGEMT/siRNA重組質粒及pUC19/EGFPU6質粒，透析袋凝膠電泳洗脫法分別回收目的片段BACEsiRNA和pUC19/EGFPU6載體片段，將BACEsiRNA片段連接入pUC19/EGFPU6載體。Xho酶切線性化的克隆為重組陽性克隆。獲得的質粒記為pUC19/EGFPU6siBACE(圖1)。pLXSN/EGFPU6siBACE重組質粒的構

14、建用EcoR、Xho雙酶切pUC19/EGFPU6siBACE以及pLXSN逆轉錄病毒載體，透析袋凝膠電泳法分別回收EGFPU6siBACE片段和pLXSN載體片段，將EGFPU6siBACE片段連接入pLXSN載體。EcoR、Xho雙酶切能夠切下約1.2 kb片段的克隆為重組陽性克隆。獲得逆轉錄病毒載體穿梭質粒pLXSN/EGFPU6siBACE(圖2)。 淀粉樣前體蛋白裂解酶特異性小干擾RNA真核表達載體的構建和鑒定2結果2.1pGEMT/siRNA的酶切鑒定          &

15、#160;    重組質粒經Xho酶切可線性化，EcoR酶切可切下約90個bp的小片段，即說明PCR產物已連于pGEMT Easy載體(圖3)。2.2pUC19/EGFPU6siBACE重組質粒的酶切鑒定    EcoR、BamH雙酶切，BamH、Sal雙酶切，以及Sal、Xho雙酶切pUC19/EGFPU6siBACE，分別獲得大小約730bp、350bp、60bp的片段，與相應的EGFP片段、U6片段以及相應的siBACE片段大小一致，EcoR、Xho雙酶切pUC19/EGFPU6siBACE獲得大小約1.2kb的片段，即EGFP

16、U6siBACE的總長度(圖4)。2.3 pLXSN/EGFPU6siBACE重組質粒的酶切鑒定               EcoR、Xho雙酶切pLXSN/EGFPU6siBACE，獲得大小約1.2kb的片段，即EGFPU6siBACE的總長度(圖5)。獲得的pLXSN/EGFPU6siBACE載體中，病毒載體的5LTR控制EGFP的表達，SV40早期啟動子控制新霉素抗性基因的表達，U6啟動子轉錄產生siRNA。3討論1995 年，Guo 和Kemph

17、ues在試圖利用反義和正義RNA 影響秀麗新小桿線蟲體內的par21 基因表達時，意外發現二者同樣地抑制了par21 基因的表達4。他們當時對這一現象大為不解。直到1998年，Fire 等證實了正義RNA 抑制基因表達，以及過去的反義RNA 對基因表達的阻斷，都是由于體外轉錄所得RNA 中污染了微量雙鏈RNA而引起。將體外轉錄得到的單鏈RNA 純化后注射線蟲時發現，基因抑制效應變得十分微弱，而經過純化的雙鏈RNA 卻正好相反，能夠高效特異性阻斷相應基因的表達。該小組將這一現象稱為RNA 干擾(RNA interference, RNAi) 5。RNAi 現象廣泛地存在于植物、果蠅、擬南芥、斑馬

18、魚、小鼠甚至錐蟲等大多數真核生物中，具有廣闊而重要的生物學意義。RNA 干擾是雙鏈RNA分子在mRNA 水平關閉相應序列基因表達或使其沉默的過程6-8，其特異性在于所挑選片段的特異性，因為凡是與之配對的相關基因均受其干擾。采用RNA 干擾技術研究基因的功能，所挑選的短鏈寡核苷酸片段必須是該基因所特有的，基因Blast 為我們提供挑選特異性片段的最佳平臺。近年來，RNA 干擾技術廣泛用于基因功能研究。研究發現，阿爾茨海默病患者的神經細胞周圍有大量的A沉積。A沉積對神經元有毒性并在AD的發病中起重要作用。由于A在AD 的發病中起著至關重要的作用，因此減少A的產生，加快其消除，阻止A聚集和形成有毒性

19、的淀粉樣斑塊，對抗A的毒性和抑制其所引起的免疫炎癥反應都可以成為AD 治療的策略。因此無論是直接或間接的治療方法，都瞄準A。目前許多學者都看好作用于分泌酶的AD 治療藥物，因為它能從源頭上減少A的產生，從根本上阻止AD 的病程發展。要減少A的產量，理論上有三條途徑：分泌酶的激動劑，可以使APP 避免經過途徑，減少A的產生；BACE抑制劑；分泌酶抑制劑。其中BACE抑制劑越來越受到人們的關注。為了證實抑制BACE不會對正常組織和細胞產生毒害作用，幾個研究小組進行了BACE基因剔除實驗9，研究表明這些基因缺失的小鼠(BACE-/-) 生長正常，對形態學、血液學以及動物行為等分析結果顯示它們與正常小

20、鼠(BACE+ /+) 無顯著差異，但BACE-/-小鼠的腦和培養的神經細胞中BACE活性消失。用BACE-/-小鼠與Swedish APP過表達的轉基因小鼠交配產生的第二代小鼠中也沒有過量的A。用表達APP 的腺病毒感染缺失BACE的胚胎神經細胞，通過質譜和凝膠電泳分析顯示不產生A。體外分析還發現，在BACE-/-小鼠的腦及培養的神經細胞抽提液中檢測不到A及BACE活性。這些實驗證實了BACE是體內主要的分泌酶，抑制BACE的活性在體內不會引起高毒性。BACE缺失小鼠的腦中不產生A，證實了可以通過抑制BACE的活性來降低A的水平，以達到治療或減緩AD 癥狀的目的，為BACE作為AD治療靶點的

21、可行性提供了試驗依據10。雖然在哺乳動物細胞中用siRNA進行RNAi的實驗技術已經基本成熟，并顯示出很好的應用前景，但化學方法合成siRNA費用昂貴、容易降解、作用時間短暫的缺點使它難以普及，在某種程度上限制了RNAi技術在哺乳動物中的應用和發展。新近涌現出了各種siRNA的合成方法，使進行大規模RNAi實驗成為可能。其中通過構建載體導入細胞后轉錄產生siRNA的方法十分簡便，費用較為低廉，抑制作用穩定，因而相繼有質粒載體、腺病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體被構建。整體而言，病毒載體的轉導效率高于質粒。相對于其他病毒載體，逆轉錄病毒具有容易包裝獲得、宿主細胞范圍廣、病毒載體本身的免疫原性

22、小及高效感染分裂期細胞等特點。本實驗通過計算機軟件分析BACE的基因序列，按照siRNA設計的原則，設計出BACE靶向的siRNA，并通過基因工程技術構建了能同時表達BACE的特異性siRNA、增強型綠色熒光蛋白(EGFP)以及Neor 的逆轉錄病毒載體。其中Neo 基因的表達可以應用G418篩選穩定轉化的細胞克隆；EGFP的表達便于用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察病毒感染效率，或利用流式細胞儀分選表達EGFP的細胞群，并可作為細胞體內示蹤的標記。因此具有很大的實用價值，為進一步試驗提供了諸多方便。后期的試驗可以將該真核表達載體包裝成逆轉錄病毒，并制備高表達APP、BACE等基因、A產量增高

23、的阿爾茨海默病細胞模型。用BACE的特異性siRNA感染模型細胞，構建的BACEsiRNA可對BACE基因在細胞內進行轉錄后抑制，切割靶基因成為無功能的小片段，達到抑制BACE基因的表達，減少BACE的產生的目的。我們觀察感染前后對BACE活性的抑制作用，特別是對阿爾茨海默病的主要致病因素A生成的重要影響，以及減少神經元死亡、降低A毒性作用的效果。本研究室正在制備含APP 瑞典突變型基因(APPSW)的轉基因小鼠。這為RNA干擾技術將來應用于哺乳動物奠定了實驗基礎，對進一步觀察RNA干擾技術在治療阿爾茨海默病中的應用具有重要意義。RNA干擾技術對抑制靶向基因的表達，為尋找最適宜的治療老年性癡呆

24、的方法提供了新的思路。參考文獻：1Dresse A, Marechal D, ScuveeMoreau J, et al. Towards pharmacological approach of Alzheimer disease based on the molecular biology of the amyloidal precursor protein(APP) J. Life Science,1994, 55(1):2179-2187.2Marjori M, Antonius JM, Matzke J, et al. RNA: guiding gene silencing J. Sc

25、ience, 2001, 293(5532):1081-1083.3Zamore PD, Tuschl T, Sharp PA, et al. RNAi: double stranded RNA directs the ATPdependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals J. Cell, 2000,101(1):25-33.4Guo S, Kemphues KJ.par 21, a gene required for establishing polarity in C.elegans embryos, encodes

26、a putative SerPThr kinase that is asymmetrically distributed J. Cell, 1995, 81(4):611-620.5Fire A, Xu S, Montgomery MK, et al. Potent and specific genetic interference by doublestranded RNA in Caenorhabditis elegans J. Nature, 1998, 391(6669):806-811.6 Brenstein E, Caudy AA, Hammond SM, et al. Role

27、for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference J. Nature, 2001, 409(6818):363-366.7Wrighton CJ, HoferWarbinek R, Moll T, et al. Inhibition of endothelial cell activation by adenovirusmediated expression of  IB, an inhibitor of the transcription factor NF2B J. J Exp Med, 1996, 183(9):1013-1022.8Song E, Kyung JS, Wang J, et al. RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis J. Nat Med, 2003, 9(3)