1、氫氧化鋁類化合物在制備治療微生物持續性感染藥物中的用途發明專利 PAGE3 氫氧化鋁類化合物在制備治療微生物繼續性感染藥物中的用途 技術領域 本發明屬化學藥物領域，涉及氫氧化鋁Al(OH)3類化合物的新的藥用用途，具體涉及氫氧化鋁類化合物在制備治療微生物繼續性感染藥物中的用途。尤其涉及氫氧化鋁類化合物在制備治療慢性乙型肝炎藥物中的用途。? 背景材料? 據研究報道，乙型肝炎病毒(HBV)可引起人類慢性乙型肝炎(慢性乙肝)，其中部分可發展為肝硬化，甚至肝癌。迄今，用于治療慢性乙肝的藥物中的一大類為針對HBV聚合酶的核苷(酸)類藥物，如Lamivudine，Entecavir，Telbivudine

2、及Adefovir等，其作用為抑制HBV核酸的復制。這類藥物必須長期服用，停藥后常發生病毒血癥，并可出現耐藥毒株；另一類治療藥物為免疫調節劑，如已上市的干擾素，分別為一般干擾素(IFN)與長效干擾素(Peg-IFN)。這類制品一方面通過誘生細胞產生的多種抗病毒蛋白，如2-5A合成酶等阻止病毒蛋白的合成而起抗病毒作用；另一方面也具有一定的免疫調節作用，如可加強巨噬細胞的作用，調節細胞表面MHC類分子的表達，以及調節T細胞的功能等。干擾素的作用沒有針對某種病毒的特異性，但有種屬特異性，但干擾素在乙肝治療中存在的主要問題是可出現骨髓抑制如白細胞下降等副作用。而且，施行顯示，僅有約30的乙肝患者對干擾

3、素治療有應答，即使長效干擾素也必須要每周注射一次，價格昂貴。但是應用干擾素后停止治療的反跳率較藥物治療為低。以上兩種治療的費用均較高。? 氫氧化鋁類化合物(統稱為Alum)是一類有三價鋁的鹽類，最早1926年用于破傷風類毒素疫苗作為佐劑，以后則用于小兒麻痹滅活疫苗(Salk疫苗)，至今已作為甲肝、乙肝疫苗等許多微生物疫苗中不可缺少的佐劑，此作用表現為可以加入后用更少量的微生物抗原，從Alum的歷史來看，作為人用疫苗的佐劑，其有激活人體的B細胞提升抗體效果的作用以及有安全性。關于Alum作為佐劑促進抗體產生的機制已在近年有較多研究，最早是由于Alum與抗原蛋白結合可以在局部沉積并延長汲取抗原的時

4、間，發展為加入Alum后可以激活B細胞母細胞化，而進一步延伸至Alum本身可激活免疫應答，近來有研究發現，注射Alum，一天后可有免疫炎癥細胞如中性粒細胞、炎性單核細胞和樹突狀細胞即可聚集在局部，Alum可以作用于人的外周血單核細胞，上調MHC-II類分子，CD40與CD83。在小鼠腹腔內注入Alum后，DC和B細胞即可內吞抗原，進一步研究發現，Alum可以促進活化caspase-1與IL-1B。而且即使沒有發生佐劑作用，Alum介導的IL-1B分泌是通過Nlrp3炎癥抗體(inflammasome)所實現的。由于發現抗體的產生必須要Th細胞介導，對不同Th細胞的分析發現，Alum主要作用于T

5、h2類細胞應答，然而與正常小鼠不同，在IL-4(Th2類細胞銀子)、IL-4R及STAT6缺陷鼠中，Alum雖然可以產生低滴度的IgG1，但是，小鼠還可產生高效價的Th1類抗體(IgG2a)。反映Alum誘生的Th2類型應答抑制了Th1類因子的應答，然而另有報道認為在體內活化炎癥體和Th2的免疫應答并不與Alum的佐劑作用及對T、B細胞的應答是直接相關的。此外，關于Alum可通過尿酸激活及募集炎癥性的DC也是一種機制。最近，施揚等發現Alum只與DC作用，直接通過細胞表面脂類的活化可促使DC攝入抗原，而且通?過細胞間粘附分子(ICAM)和淋巴細胞功能相關的抗原(Lymphocyte?funct

6、ion-associated?antigen-1，LFA-1)，可作用于CD4+細胞，并認為這一功能過程可發生于DC表面，針對多種的固相結構(如Alum晶體)而起作用。? 雖然Alum作為佐劑的作用機制在小鼠中及體外做了大量實驗研究，但迄今均未見有關進行人體臨床試驗研究的報道，更未有探究Alum單獨治療繼續性感染的作用。? 發明內容 本發明的目的是提供氫氧化鋁Al(OH)3(統稱為Alum)類化合物的新的藥用用途，尤其是Alum作為單獨成分在制備治療微生物繼續性感染藥物中的用途。特別是Alum作為單獨唯一成分在制備治療慢性乙型肝炎藥物中的用途。? 本發明的氫氧化鋁類化合物Al(OH)3統稱為A

7、lum及其衍生物(含三價鋁成分)，其各類制品廣泛用于多種疫苗的佐劑。? 本發明以復旦大學上海醫學院醫學分子病毒學實驗室早在2004年開展的乙克(抗原抗體復合物型治療性乙肝疫苗)免疫人體臨床研究中采納的Alum(KAISO4)硫酸鉀鋁制劑作為對照并據此構成了本發明。? 本發明利用長期以來作為免疫佐劑使用的氫氧化鋁類化合物作為單獨唯一成分在正常小鼠及乙肝表面抗原(HBsAg)轉基因鼠中試驗，進行Grl+細胞分布及HBsAg水平分析，實驗結果顯示，重復注射氫氧化鋁可使Grl+細胞進入脾臟以及可以使鼠血清中HBsAg水平下降；在慢性乙型肝炎患者中多次注射氫氧化鋁可致患者血清HBeAg由陽性轉為陰性，并

8、出現抗HBeAg?的抗體，及血清乙肝病毒DNA下降，實驗結果證實，所述的氫氧化鋁類化合物作為單獨唯一成分有治療乙肝患者的效果。? 本發明中，采納Alum及其衍生物作為單獨唯一成分進行動物實驗，? 用正常鼠兩次腹腔內注射Alum(KAISO4)(已公開作用于重組乙肝疫苗的佐劑)，觀察Grl+細胞在脾內分布；? Alum腹腔注射HBsAg陽性轉基因鼠(品系#59)，采納ELISA檢測方法對Alum免疫鼠進行血清HBsAg水平的測定；? 選取臨床試驗對象：慢性乙肝患者分別為6次與12次(每次間隔四周)Alum肌注；注射12次方案中，首個6次注射后停止一個月，再同樣注射第二6次；本發明中，參照乙肝免疫

9、治療的常用技術，無論6次與12次方案，注射后均隨訪24周；? 注射Alum后進行療效檢測：包括血清HBeAg定量，抗HBe測定，血清HBV?DNA定量以及HBsAg定量檢測。? 本發明中，用于注射Alum后的療效檢測試劑等，包括血清HBeAg定量(Abbott試劑)，抗HBe測定(Abbott試劑)，血清HBV?DNA定量(PCR法定量技術)，HBsAg定量(Abbott試劑)均為市售認可的商品。? 本發明經上述動物實驗以及臨床試驗結果顯示，多次注射Alum后，9-18慢性乙肝患者發生e抗原血清轉換，63出現HBeAg陰轉，同時伴有血清HBVDNA下降，與未通過注射Alum治療的HBeAg自然

10、轉換率5-8比較，說明本發明采納Alum及其衍生物作為單獨唯一成分能抑制微生物繼續性感染。? 本發明的氫氧化鋁可進一步修飾改造以提升療效，或用于其它有病毒抗原血癥的繼續性感染疾病，以及與其它藥物聯合后用于實驗及臨床研究。? 進一步本發明的Alum及其衍生物作為單獨唯一成分能制備治療慢性乙型肝炎藥物。? 該Alum及其衍生物作為單獨唯一成分制備的藥物，治療慢性乙肝患者分別為6次與12次(每次間隔四周)Alum肌注；注射12次方案中，首個6次注射后停止一個月，再同樣注射第二6次，注射后均隨訪24周。? 本發明的Alum及其衍生物作為單獨唯一成分制備的藥物，可用于治療不同類型的慢性乙肝患者；尤其適用

11、于HBeAg陽性的慢性乙肝患者。? 為了便于理解，以下將通過具體的實施例對本發明的進行具體地描述。必須要特別指出的是，具體實例僅是為了說明，顯然本領域的一般技術人員可以依據本文說明，在本發明的范圍內對本發明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納進本發明的范圍內。? 具體實施方式 實施例1正常小鼠注射Alum兩次后Grl+細胞在脾內的數目比較? 兩組C57/B1小鼠每組10只，將0.25ul?Alum(KAISO4)懸浮于250ul生理鹽水內，或僅用生理鹽水250ul分別腹腔注射，4周后再注射1次，6天后殺鼠取脾。用熒光標記的Grl抗體進行兩組脾細胞染色，同時用CD11b熒光抗體染色，用流

12、式細胞儀檢測CD11b/Grl+雙陽性細胞及Grl+細胞數，同時用抗CD3抗體染色作為對照，表1是C57/B1小鼠注射Alum兩次后脾內Grl+細胞計數結果。? 結果證實經上述Alum免疫的C57/BL鼠中脾臟中Grl+與CD11/Grl雙陽性的細胞數增多，而CD3+細胞無變化。? 實施例2Alum免疫HBsAg陽性轉基因鼠(#59)后對HBsAg水平的影響? 24只HBsAg陽性鼠隨機分為3組，A組注射鹽水，B組注射Alum，C組用HBsAg-抗HBs不加Alum。各組均腹腔內注射，共注射兩次，劑量同實例1，間隔期為4周。三組均以WHO的HBsAg標準品，用科華試劑來定量檢測。表2是Alum免疫HBsAg陽性轉基因鼠后HBsAg水平結果。? 結果顯示，單獨注射Alum兩針后，HBsAg有下降，但單獨注射鹽水或不加Alum的抗原抗體復合物，均無降低HBsAg的作用，說明Alum有一定作用，而HBs?Ag-抗HBs必須有Alum加入方可發揮作用。? 實施例3對比多次注射Alum后在乙肝患者中的特異性免疫應答? 對78名與130名HBs?Ag/HBeAg雙陽性，且抗-HBs、抗-HBe均為陰性的慢性乙肝患者分別給予6劑與12劑的Alum，每次注射間隔1個月。其中注射12劑分為兩個