1、 聚合酶鏈式反響聚合酶鏈式反響 Polymerase Chain Reaction PCR技術： 概念：經過模擬體內DNA復制的方式，在體外選擇性地將DNA某個特殊區域擴增出來的技術。 廣泛用于分子生物學和基因工程及其它與DNA鑒定相關的領域，如疾病檢測、臨床運用、商品檢疫、法醫鑒定、新藥品的開發等。PCRPCR技術產生的歷史背景技術產生的歷史背景1971年，Khorana等人就提出了利用PCR在體外擴增DNA的概念；Saiki1985和Mullis1986兩家研討室分別用改良的Kleppe法獲得了大量染色體DNA單拷貝基因；1988年，Chien從水生棲熱菌Thermus aquaticus

2、中分別出耐熱DNA聚合酶，簡稱Taq DNA聚合酶；Mullis正式確定了體外擴增DNA技術，1987年獲得專利，命名為Polymerase Chain Reaction (PCR)。PCR反響的根本過程反響的根本過程 PCR PCR由變性由變性-退火退火-延伸三個根本反響步延伸三個根本反響步驟構成：驟構成：變性變性(denaturation) (denaturation) 將模板將模板DNADNA置于置于92929696處置，使處置，使dsDNAdsDNA鏈解開成為鏈解開成為ssDNAssDNA，以便它與引物結合，以便它與引物結合. . PCR反響的根本過程反響的根本過程 退火退火(anne

3、aling)(annealing) 模板模板DNADNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至經加熱變性成單鏈后，溫度降至5555左右，引物與模板左右，引物與模板DNADNA單鏈的互補序列單鏈的互補序列配對結合成部分雙鏈；配對結合成部分雙鏈；PCR反響的根本過程反響的根本過程 延伸延伸 DNA DNA模板模板-引物結合物在引物結合物在Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶的催化作用下，以的催化作用下，以dNTPdNTP為反響原料，按堿基為反響原料，按堿基配對與半保管復制原理，引物沿配對與半保管復制原理，引物沿5353方方向延伸，最終合成一條新的與模板向延伸，最終合成一條新的與模板DNADNA鏈互鏈互補

4、的補的DNADNA鏈。鏈。PCR反響的根本要素反響的根本要素 模板模板DNADNA TaqTaq酶酶 dNTPdNTP 引物引物 Mg2+Mg2+Template DNA 模板模板DNADNA的數量與純度，是的數量與純度，是PCRPCR成敗與否的關成敗與否的關鍵環節之一。但不同類型鍵環節之一。但不同類型PCRPCR反響對模板反響對模板DNADNA數量與純度的要求不同。數量與純度的要求不同。 數量：數量：3 3106106個拷貝個拷貝 酵母菌酵母菌 10ng 10ng 細菌細菌 1ng 1ng 質粒質粒 1pg 1pg 純度純度:RAPD OD260/OD280=1.6:RAPD OD260/O

5、D280=1.61.91.9 AFLP OD260/OD280=1.7 AFLP OD260/OD280=1.71.8 1.8 DNA Polymerase Taq DNA Polymerase 來源：古細菌嗜熱水生菌來源：古細菌嗜熱水生菌(thermus aquaticus) 特點：特點： 耐高溫，在耐高溫，在70下反響下反響2 h后其殘留活性大后其殘留活性大于于90%，在，在95下反響下反響2 h后為后為40%； 在熱變性時不會被鈍化，不用在每次擴增在熱變性時不會被鈍化，不用在每次擴增反響后再加新酶；反響后再加新酶； 大大提高了擴增片段特異性和擴增效率，大大提高了擴增片段特異性和擴增效率，

6、添加了擴增長度添加了擴增長度(2.0 kb)； 具有具有53外切酶活性，但無外切酶活性，但無35外切酶外切酶活性，因此對某些單核苷酸錯配無校正功能。活性，因此對某些單核苷酸錯配無校正功能。 pfu DNA Polymerase 來源：是從來源：是從Pyrococcus furiosis 中精制而中精制而成的高保真耐高溫成的高保真耐高溫DNA聚合酶。聚合酶。 特點：特點： 它不具有它不具有53外切酶活性，但具有外切酶活性，但具有35外切酶活性，因此可糾正外切酶活性，因此可糾正PCR 過程中產生過程中產生的錯誤，使產物的堿基錯配率極低；的錯誤，使產物的堿基錯配率極低； PCR產物為平端，無產物為平

7、端，無3端突出的單端突出的單A核苷核苷酸，不能進展酸，不能進展T-A克隆。克隆。 Vent DNA Polymerase 來源：從嗜熱高溫球菌來源：從嗜熱高溫球菌(Thermococcus Litoralis)中分別出的。中分別出的。 特點：特點： 不具有不具有53外切酶活性，但具有外切酶活性，但具有35外外切酶活性，可以去除切酶活性，可以去除3錯配的堿基，具有校錯配的堿基，具有校正功能；正功能； PCR產物為平端，無產物為平端，無3端突出的單端突出的單A核苷核苷酸，不能進展酸，不能進展T-A克隆；克隆； PCR產物的擴增長度可達產物的擴增長度可達10kb以上。以上。Primers引物引物：在

8、PCR反響中與待擴增的靶DNA區段兩翼互補的寡聚核苷酸，其本質是單鏈DNA片段。primers 隨機引物：引物為隨機設計的短序列，通隨機引物：引物為隨機設計的短序列，通常為常為10bp10bp左右，擴增產物的非特異性高，左右，擴增產物的非特異性高，易受擴增條件影響；易受擴增條件影響； 特異引物：引物根據特定的特異引物：引物根據特定的DNADNA序列設計而序列設計而成，擴增產物的特異性強；成，擴增產物的特異性強； 簡并引物：是根據密碼子的簡并性原那么，簡并引物：是根據密碼子的簡并性原那么，以蛋白質序列中的氨基酸保守區反向設計以蛋白質序列中的氨基酸保守區反向設計而成的，擴增產物的特異性比較強。而成

9、的，擴增產物的特異性比較強。 InsuF 5-AATCAGCACCTATGTGGTTCTCAYYTNGTNGA-3 InsuR 5-GCTGGTACAGAGAGCAGATGGAAKYRCARCAYTG-3 其中其中 Y= C/T N= A/T/C/G K= G/T R= A/G PCR引物設計的根本原那么引物設計的根本原那么 合理的設計可在擴增的特異性和有效性之間找到一個平衡點。1 引物長度通常1830bp；2 解鏈溫度(Tm); Tm=4(G+C)+2(A+T)3 GC含量以40%60%為宜，GC太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶； PCR引物設計的根本原那么引物設計的根本原那么

10、4 ATGC4 ATGC最好隨機分布，防止最好隨機分布，防止5 5個以上的嘌呤或嘧啶核個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串陳列；苷酸的成串陳列；5 5 防止引物內部出現二級構造，以及防止兩條引物防止引物內部出現二級構造，以及防止兩條引物間互補，特別是間互補，特別是3 3端的互補，否那么會構成引物二端的互補，否那么會構成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶；聚體，產生非特異的擴增條帶； 6 6 引物引物3 3端的堿基，特別是最末及倒數第二個堿基，端的堿基，特別是最末及倒數第二個堿基，應嚴厲要求配對，以防止因末端堿基不配對而導應嚴厲要求配對，以防止因末端堿基不配對而導致致PCRPCR失敗；失敗；7 引物中有

11、或能加上適宜的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有益處；8 引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。 361 AAGGTATCACTAGAATGGCTATTAGCATTGGGTCCAAGCTTAGGAATTGCTCGAGTACCG 421 GGTATTGGTTTAGTTTTTACCGATCTCACCTCTGGAATCCCTGCCAACTTCTCTCGTTTT 481 GTCACTAACCTTCCTGCCTTCCATCGTGTCCTTGTCTTCGTGTGTGTAAAATCAGTACCT 541 GTTCCATTTGTGCCCCCAGCTG

12、AGCGCTATCTTGTGGGCCGTGTGGGTCCGGCTGCTCAT 601 CGGTCTTATAGGTGCATTGTTCGTTATGGGTACCGAGATGTGCATCAGGATGTTGATTCT 661 TTTGAAATCGAGCTAGTTTCCAAACTGGCTGATTTCATTCACTATGATTGGCATCGAAGC 721 CAGCACAGTCCCCATTCTGAGGAGGATGTTTCCCACTCTAACGAATCAACAAGTGAATGT dNTPs dNTP的質量、濃度與PCR擴增效率有親密關系， dNTP溶液的pH為7.07.5，小量分裝，-20冰凍保管。反復凍融會

13、使dNTP降解。 在PCR反響中，dNTP應為50200umol/L，尤其是留意4種dNTP的摩爾濃度要相等，假設其中任何一種濃度不同，就會引起錯配。 dNTP能與Mg2+結合,使游離的Mg2+濃度降低。Mg2+濃度 Mg2+是激活DNA polymerase的活性中心。 Mg2+對PCR的特異性和產量有顯著的影響，在普通的PCR反響中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度以1.52.0mmol/L為宜。 Mg2+濃度過高，反響特異性降低，出現非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反響產物減少。 PCR反響體系的根本成分反響體系的根本成分 1010PCR Bu

14、ffer PCR Buffer MgCl2MgCl2或或MgSO4 MgSO4 dNTP Mixture (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) dNTP Mixture (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) 引物引物 ( (隨機引物或特異引物隨機引物或特異引物) ) 模板模板DNA DNA Taq DNA polymerase Taq DNA polymerase ddH2O ddH2O 常規常規PCR反響體系反響體系 10PCR Buffer 2.5ul MgCl2 (25mM) 2.0ul dNTP(10mM) 0.2ul Forward primer(10uM)

15、1.0ul Reverse primer(10uM) 1.0ul 模板模板DNA 50ng Taq酶酶(5U/ul) 0.2ul ddH2O to 25ul緣由： 1 反響開場時反響系統中作為模板的DNA拷貝數過多，當PCR經過一定次數循環后，使DNA聚合酶缺乏以催化已擴增的DNA片段作為模板進展繼續擴增。 2 反響系統中參與的引物或dNTP的量缺乏，或者是DNA聚合酶中途失活。 PCR反響程序優化的根本原那么1 溫度與時間的設置 在規范反響中采用三溫度點法，雙鏈DNA在9095變性，再迅速冷卻至4060，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至7075，在Taq DNA聚合酶的作用下，引物鏈

16、沿模板延伸。 較短靶序列(長度為100300bp時)可采用二溫度點法，除變性溫度外，退火與延伸溫度可合二為一，普通采用94變性，65左右退火與延伸。 變性溫度與時間 變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要緣由。普通情況下，9394 l min足以使模板DNA變性，但溫度過高對酶的活性有影響。此步假設不能使模板DNA完全變性，就會導致PCR失敗。 退火溫度與時間 退火溫度是影響PCR特異性的較重要要素。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度： Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)2(A+T)復性溫度=Tm值-(510) 延伸溫度與時間 PCR反響的延伸溫度常用

17、72。PCR延伸反響的時間，可根據待擴增片段的長度而定： 1 kb的靶序列 延伸時間1min； 34kb的靶序列 延伸時間34min； 10kb以上的靶序列 延伸時間15min。 2 循環次數 PCR循環次數主要取決于模板DNA的濃度。普通的循環次數選在2540次之間，循環次數越多，非特異性產物的量亦隨之增多。 SRAP-PCR的反響程序： 94 5min 94 1min 35 1min 72 1min 94 1min 50 1min 72 1min 72 10min 楊琦，大白菜SRAP反響體系的建立與優化 5個循環 35個循環PCR的優點1 特異性強 PCR反響的特異性決議要素為：引物與模

18、板DNA特異正確的結合；堿基配對原那么；Taq DNA聚合酶合成反響的忠實性；靶基因的特異性與保守性。2 靈敏度高 能將pg級的起始待測模板擴增到ug程度。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑構成單位)；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。3 簡便、快速 PCR反響用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反響液加好后，即在PCR儀上進展擴增反響，普通在24小時完成。擴增產物普通用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推行。4 對樣本DNA的純度要求低 不需求分別病毒或細菌及培育細胞，DNA 粗制品均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體

19、腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活組織等粗制的DNA樣品進展PCR檢測。 PCR過程中常出現的問題假陰性：不出現擴增條帶 緣由： 1、模板 2、酶 3、引物 4、Mg2+ 5、反響體積的改動 6、物理緣由 7、靶序列變異 1 模板 模板中含有雜蛋白質，模板中含有Taq酶抑制劑，模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，在提取制備模板時喪失過多，或吸入酚。模板核酸變性不徹底。 2 酶失活 需改換新酶，或新舊兩種酶同時運用，以分析能否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。 需留意的是有時忘加Taq酶。3 引物 引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度能否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常

20、見緣由。 有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，呵斥低效率的不對稱擴增，對策為： 選定一個好的引物合成單位。 引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致。 如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有能夠失敗，應和引物合成單位協商處理。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。 對策為： 引物應高濃度小量分裝保管，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物蛻變降解失效。 重新設計引物。4 Mg2+濃度 Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過低

21、那么影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。5 反響體積的改動 通常進展PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul，運用多大體積進展PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時，一定要探求條件，否那么容易失敗。6 物理緣由 變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有能夠出現假陰性; 退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率；退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。 有時還有必要用規范的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的緣由之一。7 靶序列變異 如靶序

22、列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會勝利的。 假陽性：出現的假陽性：出現的PCRPCR擴增條帶與目的靶序列條帶擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。緣由：緣由：引物設計不適宜；引物設計不適宜； 靶序列或擴增產物的交叉污染。靶序列或擴增產物的交叉污染。1 引物設計不適宜 選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因此在進展PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。 靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。2 靶序列或擴增產物的交叉污染 這種污染有兩種緣由：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。 處理措施：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。 除酶及不能耐高溫的物質外，一切試劑或器材均應高壓消毒。 所用離心管及樣進槍頭等均應一次性運用。必要時，在加標本前，反響管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。 二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源