1、過釩酸鈉對照射后BET            過釩酸鈉對照射后BET    2008-5-9 12:28:18                           

2、60;                     【關鍵詞】  BET-2細胞；電離輻射；線粒體跨膜電位(m)；細胞凋亡；過釩酸鈉    摘要： 目的   研究酪氨酸磷酸酶抑制劑過釩酸鈉（Pervanadate，Per）對電離輻射作用后細胞線粒體膜電位(m)改變和細胞凋亡的影響。方法   應用流式細胞儀測定電離

3、輻射作用后鼠源性髓系白血病細胞株BET-2細胞線粒體膜電位及其在過釩酸鈉干預后的改變和細胞凋亡水平。結果   電離輻射早期可引起BET-2細胞線粒體膜電位降低，誘導細胞凋亡發生；過釩酸鈉在一定程度上穩定細胞線粒體膜電位，減少細胞凋亡。結論   過釩酸鈉可逆轉電離輻射誘導的細胞線粒體膜電位的降低，減少造血細胞凋亡的發生。    關鍵詞： BET-2細胞；電離輻射；線粒體跨膜電位(m)；細胞凋亡；過釩酸鈉    Effects of pervanadate on MMP of B

4、ET-2 cells induced by ionizing irradiation       Abstract： Objective   To study the effects of pervanadate(Per),the inhibitor of protein tyrosine phosphotases on the alterations of mitochondrial membrane potential(MMP)and the apoptosis of BET-2 cells induced b

5、y ionizing irradiation.Methods   BET-2 cells were divided into Per-treated groups and non-Per groups and incubated after ionizing irradiation.The MMP and apoptosis were measured with FCM.Results   After irradiation was given,the MMP of BET-2 cells was reduced in the early stage s

6、ignificantly,and the apoptosis appeared,and these changes had a dose-dependent pattern and a time-course fashion.Per potently enhanced the MMP of BET-2 cells and prevented irradiation-treated cells from apoptosis.Conclusion   Per reversed the repression of mitochondrial membrane potential

7、and suppress apoptosis induced by ionizing irradiation in the hematopoietic cells.    Key words： BET-2 cell;ionizing irradiation;mitochondrial membrane potential(MMP,m);apoptosis;pervanadate(Per)      細胞凋亡是電離輻射導致造血系統損傷的主要方式。預防與控制造血干/祖細胞大量凋亡，有效恢復機體造血功能，在未來

8、可能爆發的核事故、核戰爭以及腫瘤放射治療副反應控制等領域都具有十分重要的意義1。造血細胞信號轉導過程受蛋白質酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphotases，PTP）的調控2。過釩酸鈉（pervanadate，Per）作為PTP特異性抑制劑，參與細胞內多條信號通路信息的傳遞過程的調節3。通過改變PTP活性調控造血細胞受體信號轉導通路，可能成為繼重組人粒細胞集落刺激因子（G-CSF）、促紅細胞生成素（EPO）、重組血小板生長因子（TPO）等細胞因子之外的促進輻射造血損傷修復的發展方向4。本研究觀察Per對照射后BET-2細胞線粒體膜電位改變及細胞凋亡的影響，探討調控造血細

9、胞受體信號通路中PTP活性對造血細胞電離輻射損傷的保護作用。結果報告如下。    1   材料與方法    11   材料       111   BET-2細胞   BET-2細胞為促紅細胞生成素（EPO）依賴的鼠源性髓系白血病細胞株(軍事醫學科學院第3研究所張明偉惠贈)。懸浮于含10馬血清的1640完全培養基中，加入EPO至終濃度為2U/ml，置37，5CO2孵箱培養，隔日

10、換液，取指數生長期細胞用于試驗。    112   主要試劑與儀器   羅丹明123、四甲基偶氮噻唑藍(MTT,美國Sigma公司)。原釩酸鈉（NaVO3）、雙氧水（H2O2）：用雙蒸水配制為200mmol/L的儲存液，過濾除菌，4保存。促紅細胞生成素（EPO）活性為1×105U/mg，純度>95，由北京放射醫學研究所湯仲明教授提供。MODEL 450型酶聯儀（美國BIO-RAD公司）；FACSCalibur型流式細胞儀（美國Becton Dickson公司）。   &

11、#160;12   方法       121   照射條件   軍事醫學科學院放射醫學研究所60Co射線照射源，一次照射劑量分別為3，5Gy，劑量率為148157Gy/min。    122   Per制備5   將200mmol/L原釩酸鈉50l及200mmol/L H2O250l加入400l 1640培養液中，21水浴反應15min，加入5lH2O2酶終止反應。用1640培養液稀釋成應用液現配

12、現用。    123   MTT方法   將待測細胞用RPMI 1640培養液洗滌3次，臺盼蘭染色計數活細胞，用上述完全培養基分為無Per組及Per實驗組（Per終濃度為5mol），調整細胞濃度至3×105/ml，每孔100l加入96孔板中；Per用RPMI 1640遞減稀釋后，每孔加入100l，每組做3個復孔，37培養48h，加MTT(50mg/ml)20l，繼續培養4h，離心，棄上清，加入200l二甲基亞砜（DMSO），振蕩助溶，在MODEL450酶聯儀上測492，630nm雙波長的A值，以Per濃度

13、指數為橫坐標，以A值縱坐標繪圖。應用ORIGIN version294軟件中Logistic程序進行擬合處理分析。    124   細胞線粒體膜電位(m)測定6   取1×105細胞，PBS洗滌2次，加入羅丹明123儲存液至終濃度為10mol/L，室溫下平衡30min，PBS洗滌3次，PBS稀釋至細胞濃度為1×105/ml，上機檢測，激發光波長為488nm，計數1×104個細胞，測定細胞相對熒光強度，數據經流式細胞儀Kolmogorov-Smirnov Statistics軟件進行結

14、果分析。    125   細胞凋亡檢測   按德國寶靈曼公司Annexin-V-FLUOS凋亡分析試劑盒說明書進行。取約1×106細胞，PBS洗滌，200g×5min，棄盡上清，重懸于100lAnnexin-V-FLUOS標記緩沖液1000l溶液中預先加入20lAnnexin-V-FLUOS單抗及20l50g/ml溴化丙錠(PI)中，避光，室溫放置1015min，加溶液(100mmolHepes/NaOH,pH74,140mmolNaCl,5mmolCaCl2)04ml，上機檢測。2 

15、;  結果    21   BET-2對EPO細胞增殖反應性（圖1）   培養基中EPO濃度<05U/ml時，BET-2細胞增殖停止；在12U/ml之間即有良好促增殖作用；EPO濃度>4U/ml，其促增殖能力已達飽和。表明BET-2細胞對EPO有較好的依賴性，保持了穩定的生物學特性。    圖1   BET-2對EPO的增殖反應性（略）    22   Per對BET-2細胞

16、增殖反應性（圖2）   當Per濃度<005mol/L時，對細胞無明顯效果；Per625mol/L時，導致細胞死亡；而在13125mol/L時可明顯促進BET-2細胞在缺乏EPO狀況下的增殖。提示適量Per具有細胞因子樣作用，可促進BET-2細胞增殖。因此，在下述實驗中，使用Per的終濃度為5mol/L。    圖2   BET-2對Per的增殖反應性（略）    23   Per對電離輻射所致BET-2細胞增殖抑制的影響（圖3） 

17、0; 對于未照射的BET-2細胞，適當濃度Per可明顯促進BET-2細胞在缺乏EPO狀況下的增殖；對于5Gy射線照射后的BET-2細胞，13125mol/L的Per仍能明顯促進BET-2細胞在缺乏EPO狀況下的增殖。提示電離輻射可能導致細胞信號轉導過程中負調控酪氨酸磷酸酶作用的增強，抑制細胞的增殖。    24   Per對電離輻射后BET-2細胞MMP改變的影響   未處理的BET-2細胞相對熒光強度為18111±899，3Gy照射細胞相對熒光強度為16420±870，5Gy照射細胞相對熒光強

18、度為13093±910，組間比較差異均有統計學意義(P<001)，表明隨著照射劑量增加，細胞線粒體膜電位(m)呈逐漸下降的趨勢。5Gy照射12h后細胞相對熒光強度為10263±856，而照射即刻加入Per（終濃度為5mol/L），細胞相對熒光強度為16837±915(未處理的BET-2細胞相對熒光強度為18359±1422)，組間比較差異有統計學意義(P<001)，表明Per可明顯緩解照射后BET-2細胞線粒體膜電位(m)下降的程度。    25   Per對電離輻射后BET-2細胞凋亡的影響   5Gy照射后12h,存活細胞（LL象限）比例為6729