1、過釩酸鈉對照射后BET            過釩酸鈉對照射后BET    2008-5-9 12:28:18                           

2、60;                     【關(guān)鍵詞】  BET-2細(xì)胞；電離輻射；線粒體跨膜電位(m)；細(xì)胞凋亡；過釩酸鈉    摘要： 目的   研究酪氨酸磷酸酶抑制劑過釩酸鈉（Pervanadate，Per）對電離輻射作用后細(xì)胞線粒體膜電位(m)改變和細(xì)胞凋亡的影響。方法   應(yīng)用流式細(xì)胞儀測定電離

3、輻射作用后鼠源性髓系白血病細(xì)胞株BET-2細(xì)胞線粒體膜電位及其在過釩酸鈉干預(yù)后的改變和細(xì)胞凋亡水平。結(jié)果   電離輻射早期可引起B(yǎng)ET-2細(xì)胞線粒體膜電位降低，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生；過釩酸鈉在一定程度上穩(wěn)定細(xì)胞線粒體膜電位，減少細(xì)胞凋亡。結(jié)論   過釩酸鈉可逆轉(zhuǎn)電離輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體膜電位的降低，減少造血細(xì)胞凋亡的發(fā)生。    關(guān)鍵詞： BET-2細(xì)胞；電離輻射；線粒體跨膜電位(m)；細(xì)胞凋亡；過釩酸鈉    Effects of pervanadate on MMP of B

4、ET-2 cells induced by ionizing irradiation       Abstract： Objective   To study the effects of pervanadate(Per),the inhibitor of protein tyrosine phosphotases on the alterations of mitochondrial membrane potential(MMP)and the apoptosis of BET-2 cells induced b

5、y ionizing irradiation.Methods   BET-2 cells were divided into Per-treated groups and non-Per groups and incubated after ionizing irradiation.The MMP and apoptosis were measured with FCM.Results   After irradiation was given,the MMP of BET-2 cells was reduced in the early stage s

6、ignificantly,and the apoptosis appeared,and these changes had a dose-dependent pattern and a time-course fashion.Per potently enhanced the MMP of BET-2 cells and prevented irradiation-treated cells from apoptosis.Conclusion   Per reversed the repression of mitochondrial membrane potential

7、and suppress apoptosis induced by ionizing irradiation in the hematopoietic cells.    Key words： BET-2 cell;ionizing irradiation;mitochondrial membrane potential(MMP,m);apoptosis;pervanadate(Per)      細(xì)胞凋亡是電離輻射導(dǎo)致造血系統(tǒng)損傷的主要方式。預(yù)防與控制造血干/祖細(xì)胞大量凋亡，有效恢復(fù)機(jī)體造血功能，在未來

8、可能爆發(fā)的核事故、核戰(zhàn)爭以及腫瘤放射治療副反應(yīng)控制等領(lǐng)域都具有十分重要的意義1。造血細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程受蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphotases，PTP）的調(diào)控2。過釩酸鈉（pervanadate，Per）作為PTP特異性抑制劑，參與細(xì)胞內(nèi)多條信號通路信息的傳遞過程的調(diào)節(jié)3。通過改變PTP活性調(diào)控造血細(xì)胞受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可能成為繼重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）、促紅細(xì)胞生成素（EPO）、重組血小板生長因子（TPO）等細(xì)胞因子之外的促進(jìn)輻射造血損傷修復(fù)的發(fā)展方向4。本研究觀察Per對照射后BET-2細(xì)胞線粒體膜電位改變及細(xì)胞凋亡的影響，探討調(diào)控造血細(xì)

9、胞受體信號通路中PTP活性對造血細(xì)胞電離輻射損傷的保護(hù)作用。結(jié)果報告如下。    1   材料與方法    11   材料       111   BET-2細(xì)胞   BET-2細(xì)胞為促紅細(xì)胞生成素（EPO）依賴的鼠源性髓系白血病細(xì)胞株(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院第3研究所張明偉惠贈)。懸浮于含10馬血清的1640完全培養(yǎng)基中，加入EPO至終濃度為2U/ml，置37，5CO2孵箱培養(yǎng)，隔日

10、換液，取指數(shù)生長期細(xì)胞用于試驗。    112   主要試劑與儀器   羅丹明123、四甲基偶氮噻唑藍(lán)(MTT,美國Sigma公司)。原釩酸鈉（NaVO3）、雙氧水（H2O2）：用雙蒸水配制為200mmol/L的儲存液，過濾除菌，4保存。促紅細(xì)胞生成素（EPO）活性為1×105U/mg，純度>95，由北京放射醫(yī)學(xué)研究所湯仲明教授提供。MODEL 450型酶聯(lián)儀（美國BIO-RAD公司）；FACSCalibur型流式細(xì)胞儀（美國Becton Dickson公司）。   &

11、#160;12   方法       121   照射條件   軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所60Co射線照射源，一次照射劑量分別為3，5Gy，劑量率為148157Gy/min。    122   Per制備5   將200mmol/L原釩酸鈉50l及200mmol/L H2O250l加入400l 1640培養(yǎng)液中，21水浴反應(yīng)15min，加入5lH2O2酶終止反應(yīng)。用1640培養(yǎng)液稀釋成應(yīng)用液現(xiàn)配

12、現(xiàn)用。    123   MTT方法   將待測細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌3次，臺盼蘭染色計數(shù)活細(xì)胞，用上述完全培養(yǎng)基分為無Per組及Per實驗組（Per終濃度為5mol），調(diào)整細(xì)胞濃度至3×105/ml，每孔100l加入96孔板中；Per用RPMI 1640遞減稀釋后，每孔加入100l，每組做3個復(fù)孔，37培養(yǎng)48h，加MTT(50mg/ml)20l，繼續(xù)培養(yǎng)4h，離心，棄上清，加入200l二甲基亞砜（DMSO），振蕩助溶，在MODEL450酶聯(lián)儀上測492，630nm雙波長的A值，以Per濃度

13、指數(shù)為橫坐標(biāo)，以A值縱坐標(biāo)繪圖。應(yīng)用ORIGIN version294軟件中Logistic程序進(jìn)行擬合處理分析。    124   細(xì)胞線粒體膜電位(m)測定6   取1×105細(xì)胞，PBS洗滌2次，加入羅丹明123儲存液至終濃度為10mol/L，室溫下平衡30min，PBS洗滌3次，PBS稀釋至細(xì)胞濃度為1×105/ml，上機(jī)檢測，激發(fā)光波長為488nm，計數(shù)1×104個細(xì)胞，測定細(xì)胞相對熒光強(qiáng)度，數(shù)據(jù)經(jīng)流式細(xì)胞儀Kolmogorov-Smirnov Statistics軟件進(jìn)行結(jié)

14、果分析。    125   細(xì)胞凋亡檢測   按德國寶靈曼公司Annexin-V-FLUOS凋亡分析試劑盒說明書進(jìn)行。取約1×106細(xì)胞，PBS洗滌，200g×5min，棄盡上清，重懸于100lAnnexin-V-FLUOS標(biāo)記緩沖液1000l溶液中預(yù)先加入20lAnnexin-V-FLUOS單抗及20l50g/ml溴化丙錠(PI)中，避光，室溫放置1015min，加溶液(100mmolHepes/NaOH,pH74,140mmolNaCl,5mmolCaCl2)04ml，上機(jī)檢測。2 

15、;  結(jié)果    21   BET-2對EPO細(xì)胞增殖反應(yīng)性（圖1）   培養(yǎng)基中EPO濃度<05U/ml時，BET-2細(xì)胞增殖停止；在12U/ml之間即有良好促增殖作用；EPO濃度>4U/ml，其促增殖能力已達(dá)飽和。表明BET-2細(xì)胞對EPO有較好的依賴性，保持了穩(wěn)定的生物學(xué)特性。    圖1   BET-2對EPO的增殖反應(yīng)性（略）    22   Per對BET-2細(xì)胞

16、增殖反應(yīng)性（圖2）   當(dāng)Per濃度<005mol/L時，對細(xì)胞無明顯效果；Per625mol/L時，導(dǎo)致細(xì)胞死亡；而在13125mol/L時可明顯促進(jìn)BET-2細(xì)胞在缺乏EPO狀況下的增殖。提示適量Per具有細(xì)胞因子樣作用，可促進(jìn)BET-2細(xì)胞增殖。因此，在下述實驗中，使用Per的終濃度為5mol/L。    圖2   BET-2對Per的增殖反應(yīng)性（略）    23   Per對電離輻射所致BET-2細(xì)胞增殖抑制的影響（圖3） 

17、0; 對于未照射的BET-2細(xì)胞，適當(dāng)濃度Per可明顯促進(jìn)BET-2細(xì)胞在缺乏EPO狀況下的增殖；對于5Gy射線照射后的BET-2細(xì)胞，13125mol/L的Per仍能明顯促進(jìn)BET-2細(xì)胞在缺乏EPO狀況下的增殖。提示電離輻射可能導(dǎo)致細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中負(fù)調(diào)控酪氨酸磷酸酶作用的增強(qiáng)，抑制細(xì)胞的增殖。    24   Per對電離輻射后BET-2細(xì)胞MMP改變的影響   未處理的BET-2細(xì)胞相對熒光強(qiáng)度為18111±899，3Gy照射細(xì)胞相對熒光強(qiáng)度為16420±870，5Gy照射細(xì)胞相對熒光強(qiáng)

18、度為13093±910，組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<001)，表明隨著照射劑量增加，細(xì)胞線粒體膜電位(m)呈逐漸下降的趨勢。5Gy照射12h后細(xì)胞相對熒光強(qiáng)度為10263±856，而照射即刻加入Per（終濃度為5mol/L），細(xì)胞相對熒光強(qiáng)度為16837±915(未處理的BET-2細(xì)胞相對熒光強(qiáng)度為18359±1422)，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<001)，表明Per可明顯緩解照射后BET-2細(xì)胞線粒體膜電位(m)下降的程度。    25   Per對電離輻射后BET-2細(xì)胞凋亡的影響   5Gy照射后12h,存活細(xì)胞（LL象限）比例為6729