1、人胎盤絨毛提取物體外對T細胞應答的抑制效應    作者：肇靜嫻，曾耀英，江遜，季煜華，劉毅 【關(guān)鍵詞】  胎盤絨毛；滋養(yǎng)層；免疫抑制；T淋巴細胞；色氨酸加氧酶    【Abstract】 AIM: To have a progressive knowledge of the inhibitory capacity of placental villi on T cell response and its changes in the 3 trimesters of pregnancy. METHODS: 

2、 Tissue extracts were prepared from early (10 weeks), middle (20 weeks) and late (37 weeks) placental villi, and their impacts on T cell activation were evaluated by detecting CD69 and CD25 expressions, impacts on proliferation were analyzed by method of WST1, and impacts on Th1/Th2 cytokine reperto

3、ire were measured by cytometric bead array (CBA). Content of indoleamine 2,3dioxygenase (IDO) in the tissue extracts was detected by Western blotting. RESULTS: All tissue extracts from the 3 trimesters showed inhibitory effects on activation, proliferation and cytokine secretion of human peripheral

4、T cells stimulated by PHA, and also on activation of mouse T cell activation stimulated by ConA (P<0.01). In general, the 20 week extracts had the strongest immunosuppressive effects. The content of IDO was much more in 20 week extracts than in 37 week extracts, and there was only trace amount of

5、 IDO in 10 week extracts. CONCLUSION: Villous extracts from the 3 trimesters of pregnancy had different degrees of inhibitory effects on T cell response, and their inhibitions to different T cell behaviors were not consistent, indicating their different expression patterns (quality and quantity) of

6、inhibitory factors.    【Keywords】 placental villus; trophoblast; immunosuppression; T lymphocytes; tryptophan oxygenase    【摘要】 目的： 了解胎盤絨毛對T細胞應答的抑制能力及其在妊娠周期不同階段的變化. 方法： 制備孕10，20和37 wk的絨毛提取物，通過檢測CD69和CD25分子的表達，評價其對T細胞活化的影響，WST1法分析其對T細胞增殖的影響，流式微球陣列（CBA）法分析其對Th1/Th2細胞因子譜的影

7、響，并以Western印跡法分析提取物中吲哚胺2,3雙加氧酶（IDO）的含量. 結(jié)果： 孕早、中、晚期的胎盤絨毛提取物均能顯著抑制植物血凝素(PHA)誘導的人T細胞活化，增殖，細胞因子分泌以及ConA誘導的小鼠T細胞活化（P<0.01）. 但三個時期的提取物對上述不同T細胞行為的抑制強度不同，以20 wk提取物的抑制作用最強. 提取物中IDO蛋白的含量20 wk最高，37 wk次之，10 wk最低. 結(jié)論： 妊娠不同時期的絨毛滋養(yǎng)細胞均能夠抑制T細胞應答，但抑制強度不一致，且對T細胞不同行為的抑制存在分離現(xiàn)象，提示妊娠不同時期的絨毛滋養(yǎng)細胞表達抑制因子的模式不同.  

8、  【關(guān)鍵詞】 胎盤絨毛；滋養(yǎng)層；免疫抑制；T淋巴細胞；色氨酸加氧酶     0引言    在胎盤局部，受精卵來源的絨毛滋養(yǎng)細胞和絨毛外滋養(yǎng)細胞作為胎兒細胞的代表，處于母胎界面的最前沿，因此已成為研究母胎耐受機制中胎兒因素的最重要靶點. 雖然已知絨毛滋養(yǎng)細胞表達HLAG, FasL, 吲哚胺2,3雙加氧酶（indoleamine 2,3dioxygenase, IDO），以及分泌高濃度的雌、孕激素都可能參與了降低母體免疫系統(tǒng)對胎兒抗原的應答1-4，但以往研究多是對上述單個因素的作用進行分析，而對胎盤絨毛所具有的整體

9、的免疫抑制能力，及其在妊娠不同階段有何變化等問題的研究報道較少. 本研究擬從胎盤絨毛提取物的角度，對妊娠早、中、晚期胎盤絨毛的細胞免疫抑制能力進行評價，并希望通過此研究思路為發(fā)現(xiàn)新的免疫耐受相關(guān)機制奠定基礎.&n    bsp;   1材料和方法    1.1材料K2EDTA抗凝靜脈血取自8例健康志愿者，男性，年齡1835歲；SPF級Balb/cJ近交系小鼠，雄性，810 wk，購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心；碘化丙錠（propidium Iodide, PI）、刀豆蛋白A（ConA）、植物血凝素（

10、phytohemagglutinin，PHA）均購自美國Sigma公司；NycoPrepTM淋巴細胞分離液購自挪威Nycomed Pharma AS公司；WST1購自德國Boehringer Mannhein公司；人Th1/Th2細胞因子流式微球檢測（cytometric bead array, CBA）試劑盒以及抗人和抗小鼠CD3FITC, CD69PE, CD25PE mAb均購自美國BD PharMingen公司；兔抗IDO 抗體購自美國CHEMICON 公司；小鼠抗actin 抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔IgG, HRP標記的兔抗小鼠IgG均購自美國Santa Cruz公

11、司；RPIM 1640培養(yǎng)基，胎牛血清購自美國GIBCO BRL公司；BIORAD 3550 酶標儀，Amersham MiniVE垂直板電泳儀，F(xiàn)ACSCalibur型流式細胞儀.    1.2方法    1.2.1胎盤絨毛提取物的制備絨毛組織取自人工流產(chǎn)（孕10 wk）、孕中期水囊引產(chǎn)（孕20 wk）和行擇期剖宮產(chǎn)（孕37 wk）的婦女. 剪取末梢細小絨毛組織，大量冷PBS多次沖洗，再將其剪碎，經(jīng)超聲破碎制成勻漿，以上操作均在冰浴中進行. 4，15 000 g，離心15 min吸取上清，經(jīng)0.22 m濾膜過濾，分裝，-20保存.

12、檢測蛋白濃度約為0.2 g/L.    1.2.2T細胞活化和增殖誘導及實驗分組分離健康人外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC），或從小鼠淋巴結(jié)制備淋巴細胞，以含100 mL/L FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)液懸浮，細胞密度為1.5×109 /L，96孔板培養(yǎng)，每孔定容200 L. 設置不加刺激劑的空白對照組（control）和不加刺激劑但加入不同體積百分比（5%, 10%, 15%）絨毛提取物（孕10, 20或37 wk）的實驗組，以及加刺激劑的（PHA/ConA）對照組和加刺激劑同時

13、加入不同體積百分比絨毛提取物的實驗組，每組設4個復孔. 刺激人T細胞活化和增殖用PHA 10 mg/L，刺激小鼠T細胞活化和增殖用 ConA 5 mg/L.    1.2.3流式細胞術(shù)分析T細胞活化人PBMC或小鼠淋巴細胞按方法1.2.2進行分組培養(yǎng)， 6 h后收集細胞，常規(guī)方法標記抗人或抗小鼠的CD3FITC, CD69PE抗體，培養(yǎng)24 h后按相同方法標記CD3FITC, CD25PE抗體，流式細胞術(shù)分析CD69和CD25陽性T細胞百分率.    1.2.4WST1法檢測T細胞增殖健康人PBMC按方法1.2.2進行分組培養(yǎng)，每孔定

14、容100 L，各組設置5個復孔. 培養(yǎng)48 h后每孔加入10 L WST1，輕輕振蕩，37繼續(xù)孵育2 h，用酶標儀進行檢測. 檢測波長為450 nm，參考波長為600 nm.    1.2.5PI染色檢測細胞活力收集培養(yǎng)的PBMC, PBS離心洗滌1次，380 L PBS重懸，加入50 mg/L的PI染液20 L混勻，5 min后即用流式細胞儀進行檢測. PI染色陽性細胞為死細胞.    1.2.6流式微球法檢測培養(yǎng)上清中的細胞因子健康人PBMC按方法1.2.2進行分組培養(yǎng)，6 h和24 h分別收集培養(yǎng)上清，使用人 Th1/Th2 C

15、BA 試劑盒，按文獻5，檢測IL2, IL4, IL5, IL10, TNF和IFN6種細胞因子的濃度，檢測范圍為205000 pg/mL.    1.2.7Western印跡法檢測絨毛提取物中的IDO蛋白將絨毛提取物10倍濃縮，100 g/L SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）分離蛋白，每道上樣量20 g，以actin Mr約為43作為內(nèi)參，因其與IDO蛋白Mr約為45接近，因此利用2塊膠以相同條件進行. 電轉(zhuǎn)移法將膠上蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，TBS液漂洗，50 g/L脫脂奶粉封閉，TBS液漂洗，一抗（兔抗IDO 0.5 g/mL或小鼠抗actin

16、1100稀釋）孵育60 min. TBS液洗膜后，二抗（HRP標記的羊抗兔 IgG 11000稀釋, 兔抗小鼠 IgG 15000稀釋）孵育60 min. TBS液漂洗，ECL發(fā)光，X光片顯像，分析成像.    統(tǒng)計學處理： 統(tǒng)計軟件為SPSS12.0，獲得的數(shù)據(jù)用x±s表示，統(tǒng)計方法用方差分析.2結(jié)果    2.1胎盤絨毛提取物對人T細胞活化的影響各期的絨毛提取物對靜息態(tài)的人T細胞CD69和CD25分子表達（CD69+T細胞為7%左右，CD25+T細胞為9%左右）均無顯著影響，但對PHA誘導的T細胞CD69和CD25表達均

17、具有顯著的抑制作用（P<0.01）. 表1顯示各組抑制率，抑制率按(PHAControl)(PHA+%extractControl)/(PHAControl)×100%計.    2.2胎盤絨毛提取物對人T細胞增殖的影響鑒于15%的絨毛提取物對T細胞活化的抑制作用過強，因此選取5%和10    %這2個濃度研究其對T細胞增殖的影響. 培養(yǎng)48 h后，WST1法檢測各孔細胞吸光值. PHA對照組與空白對照組比較細胞明顯增殖（P<0.01）；加入5%或10%各期絨毛提取物，PHA誘導的增殖被明顯抑制（P&l

18、t;0.01），其中以20 wk提取物的抑制作用最強（圖1）.表1不同體積百分比各期絨毛提取物對PHA誘導的人T細胞CD69和CD25表達的抑制率 圖1胎盤絨毛提取物對PHA誘導的人T細胞增殖的影響    2.3胎盤絨毛提取物對小鼠T細胞活化的影響10%體積比的各期胎盤絨毛提取物對ConA誘導的小鼠T細胞CD69和CD25表達均具有顯著的抑制作用（P<0.01，圖2）.  bP<0.01 vs ConA.圖2胎盤絨毛提取物對ConA誘導的小鼠T細胞活化的影響    2.4胎盤絨毛提取物對細胞活力的影響培養(yǎng)24 h

19、后，加入不同百分比20 wk提取物的各組死亡細胞百分率略高于空白對照組（P<0.05）；PHA對照組死亡細胞百分率明顯高于空白對照組（P<0.01），但PHA加提取物的各組死亡細胞百分率均明顯低于PHA對照組（P<0.01，圖3）.     2.5孕早、中、晚期胎盤絨毛提取物IDO蛋白含量Western 印跡法檢測，20 wk提取物中IDO蛋白的含量最高，37 wk提取物次之，而10 wk提取物中只含有微量的IDO蛋白（圖4）. 圖4各期胎盤絨毛提取物中IDO蛋白的相對含量    2.6胎盤絨毛提取物對PBMC分泌細

20、胞因子的影響培養(yǎng)6 h后，未加刺激劑的各組無論有否加胎盤絨毛提取物，培養(yǎng)上清中6種細胞因子均未檢出；培養(yǎng)24 h后，空白對照組培養(yǎng)上清IFN為（54.2±5.1） pg/mL，加入10%體積各期提取物后，均檢測不出. 經(jīng)PHA刺激6和24 h后，10%體積比各期提取物對細胞因子的影響見表2. 全部樣品IL4, IL5和IL10均未檢出.表2各期10%胎盤絨毛提取物對細胞因子分泌的抑制作用    3討論    胎兒對于母體來說相當于半同種異基因移植物，而同種移植排斥反應的實質(zhì)是受者T細胞介導的針對供者同種異基因抗原的免疫應答，

21、因此本課題主要研究絨毛提取物對T細胞應答的影響. 結(jié)果顯示，孕早、中、晚期的胎盤絨毛提取物均能抑制PHA誘導的人外周血T細胞活化、增殖和細胞因子分泌，而且這些作用并非由細胞毒性引起. 提示在母胎免疫耐受的維持中，胎兒來源的滋養(yǎng)細胞除不表達某些主要的MHC I類分子而減少母體免疫系統(tǒng)的攻擊外，還具有一套能夠主動抑制母體免疫攻擊的“防御系統(tǒng)”. 人胎盤絨毛提取物對小鼠T細胞活化的抑制作用提示，絨毛提取物中存在一些保守的、無種屬特異性的免疫抑制因素，如高濃度的雌、孕激素對人和小鼠的T細胞活化、增殖均具有抑制作用6.    IDO是細胞內(nèi)一種催化色氨酸（Trp）沿犬尿氨酸

22、途徑降解的限速酶，體內(nèi)、外研究都表明，IDO能夠抑制T細胞增殖，是機體天然存在的免疫抑制機制3，7. 一般認為，IDO抑制T細胞增殖的原因是它降解Trp，造成缺乏Trp的微環(huán)境，這對一般細胞影響似不明顯，而T 細胞由于存在一個對Trp 敏感的檢查點，使細胞增殖停滯于G1期中期8. 胎盤滋養(yǎng)層細胞產(chǎn)生的IDO能阻斷針對胎兒組織表達的父本HLA等位基因產(chǎn)物的母體活化T細胞攻擊，因而是防止母體T細胞排斥同種異基因胎兒的必要因素4. 本研究結(jié)果顯示，20 wk提取物中IDO的濃度最高，37 wk提取物次之，而10 wk提取物中只含有微量的IDO，與文獻報道的IDO于胎盤種植后13 wk時才明顯表達相符9. 這一結(jié)果與前述絨毛提取物對T細胞增殖的抑制能力20 wk最強，37 wk次之，10 wk最弱有很好的一致性；由于IDO并不影響T細胞的活化10，因此，與