1、抑癌基因p53的突變與修護激活031134 劉瀟欽摘 要：p53作為一種代表性的抑癌蛋白，是腫瘤分子生物學(xué)的研究熱點。然而，野生型的p53通過不同位點的點突變會形成不同類型的突變型p53，突變型p53不僅喪失了野生型p53的抑癌功能，更獲得了一些癌癥癥狀起促進作用的新功能。本文著重介紹野生p53的結(jié)構(gòu)和功能，闡述其突變的方法和類型，羅列突變p53的危害，以及重新激活修護p53的方法。關(guān)鍵詞 p53；突變；激活修護野生型p53的介紹人的p53基因位于第17號染色體短臂，分布于大約20Kb的DNA區(qū)域中。它由11個外顯子和10個內(nèi)含子組成。啟動子中不含有CAAT、TATA、GC盒等常見啟動序列，轉(zhuǎn)

2、錄產(chǎn)生2.5kbmRNA，翻譯生成由393個氨基酸殘基組成的，分子量為53kd的蛋白質(zhì)。(1)p53 蛋白包括3個功能調(diào)節(jié)區(qū)域(如圖1): 圖 1(1)N-端的活化：通過與轉(zhuǎn)錄因子TFD結(jié)合而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活功能，序列上又可細分為轉(zhuǎn)錄活化域和富含脯氨酸的SH3域；(2) 序列中段DNA結(jié)合域：能與特定的DNA 序列結(jié)合, 調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，p53 突變多發(fā)于此區(qū)域；(3）C端功能域：包含核定位信號、出核信號、四聚化結(jié)構(gòu)域及一個調(diào)控功能域, 參與p53 細胞內(nèi)定位、四聚化以及對中央DNA 結(jié)合域的調(diào)控作用。(2)(3)正常情況下細胞內(nèi)p53蛋白的含量很低,這主要是由MDM2介導(dǎo)的p53快速降解來

3、調(diào)節(jié)的。當(dāng)應(yīng)激各種損傷信號時, p53蛋白被磷酸化修飾, 避免了在細胞質(zhì)中發(fā)生的MDM2對p53的降解，從而使核內(nèi)的p53水平迅速升高。激活的p53通過其DNA 結(jié)合區(qū)結(jié)合靶基因的啟動子。并借助其轉(zhuǎn)錄激活區(qū)誘導(dǎo)其下游基因的轉(zhuǎn)錄表達。p53活化對細胞有兩種潛在影響:一是使細胞停止在G1或G2期，導(dǎo)致?lián)p傷的細胞得以修復(fù)；二是誘發(fā)細胞凋亡，去除變異細胞。但p53的抑癌功能常因突變而消失，使細胞無限分裂增殖，導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。(3) (4)但腫瘤細胞中的p53或因突變而失活，或因與宿主或病毒的某種蛋白質(zhì)的結(jié)合而失活。失活后的p53蛋白便喪失上述功能。P53的調(diào)控機制近年來，對p53抑癌機制研究日趨深入。

4、在不同的癌癥中，其調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)各有特點。下面就一個典型的調(diào)節(jié)通路：MDM2的調(diào)控作簡要介紹。癌基因MDM2編碼的蛋白質(zhì)通過與p53 的17-22位氨基酸殘基相結(jié)合，阻斷p53的轉(zhuǎn)錄調(diào)控通路。MDM2還可與p53特異的泛素酶共同作用, 促進p53蛋白降解。MDM2- p53復(fù)合物廣泛存在于s和G2/M期細胞中。p53激活MDM2的表達，而生成的MDM2蛋白抑制p53活性，形成MDM2依賴的負反饋調(diào)節(jié)機制。研究發(fā)現(xiàn)，MDM2在肉瘤, 乳腺癌, 腦瘤, 膀胱癌, 肺癌和白血病中的表達量明顯高于正常組織或細胞。乙?；钦{(diào)節(jié)p53蛋白活性十分重要的方式：1.乙?；煞忾]p53賴氨酸泛素結(jié)合位點，抑制其降解，

5、增強p53穩(wěn)定性。2.乙?；兄谵D(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性的短暫分離，對下游靶基因的活化起重要作用。3.乙?；饔没蛟S誘發(fā)p53C端構(gòu)象變化，破壞C端的回折，提高p53與DNA的結(jié)合能力。4.乙?；蓞f(xié)調(diào)p53在胞質(zhì)與胞核間的分隔分布。磷酸化可增強p53與乙?；傅南嗷プ饔?，促進p53 C端乙?；?，建立p53磷酸化-乙?；壜?lián)反應(yīng)，p53在細胞內(nèi)聚集并向核內(nèi)轉(zhuǎn)位。修飾后的p53形成有生物學(xué)活性的四聚體，與靶基因的p53反應(yīng)元件結(jié)合，控制著下游靶基因的表達，從而引起細胞生長阻滯、凋亡。研究發(fā)現(xiàn)MDM2的酸性結(jié)構(gòu)域是抑制p300 介導(dǎo)的p53乙?；谋匾蛩?，該結(jié)構(gòu)域還介導(dǎo)p53去乙?；饔?，進而影響p53的

6、功能和活性。研究發(fā)現(xiàn)p14ARF 不但可使MDM2失活,還可促進p53蛋白的穩(wěn)定表達。檢查點激酶1和檢查點激酶2可誘導(dǎo)p53磷酸化，削弱MDM2與p53的結(jié)合，從而提高p53穩(wěn)定性。(3)p53的突變類型TP53 突變在腫瘤發(fā)生中是非常常見的, 不同位點的點突變產(chǎn)生了多種形式的突變P53蛋白(1)。P53突變的類型包括基因片段缺失、插入, 點突變引起的錯義突變, 以及雜合性缺失。但是在所有p53 突變形式中, 占主導(dǎo)地位的還是因點突變引起的錯義突變, 其比例約占總體的80%。而在這些p53錯義突變中, 發(fā)生在DBD區(qū)的點突變比例高達97%。實際上，p53的DBD 區(qū)每一個氨基酸都可發(fā)生點突變而

7、形成相應(yīng)的突變體,。但是以下6個位點的突變在癌癥中高頻率出現(xiàn)，與癌癥進程緊密關(guān)聯(lián)，被稱為熱點突變。它們分別是: R175、G245、R248、R249、R273、R282(標(biāo)注如圖1)。p53的突變可以分為三類：1. DNA 結(jié)合缺陷突變體：是指那些負責(zé)與特定DNA序列結(jié)合的氨基酸殘基發(fā)生點突變，致使p53與DNA結(jié)合能力減弱。例如R273H(小鼠中為R270H)。2. 構(gòu)象突變體：是指那些發(fā)生點突變后改變了原來野生型p53的整體構(gòu)象。例如R175H(小鼠中為R172H)。3. 以上突變都改變了p53 的三維結(jié)構(gòu), 而R273H 突變失去DNA結(jié)合能力是因為273位突變后的精氨酸殘基支鏈過長,

8、空間效應(yīng)抑制了和DNA的結(jié)合。從功能上來說,突變型p53在喪失了抑癌基因功能后，還可以通過顯性負效應(yīng)抑制野生型p53的活性。顯性負效應(yīng)是指一個等位基因上發(fā)生的突變損害了另一個等位基因的正常功能， 使其產(chǎn)生沒有活性的蛋白。在癌癥發(fā)生過程中， 通常是p53,的一個等位基因發(fā)生突變，另一個保持野生型p53活性。這時在細胞內(nèi)同時存在突變型p53和野生型p53兩種蛋白單體，突變型p53與野生型53 通過彼此C端四聚化結(jié)構(gòu)域形成寡聚蛋白時，突變型p53抑制野生型p53活性，占據(jù)主導(dǎo)地位。最終，在癌癥的發(fā)展過程中，野生型53 等位基因丟失。(2)后果1. 突變型p53能夠形成更穩(wěn)定的四聚體：以往的研究證明p

9、53 在正常細胞內(nèi)含量很低，野生型p53是通過修飾避免了水解從而得到激活。而突變p53是怎樣避免水解的呢？研究發(fā)現(xiàn), MDM2作為p53最主要的負調(diào)控因子，它的轉(zhuǎn)錄表達處于p53的控制之下。突變p53不能有效激活MDM2表達，使p53失去了MDM2 的負調(diào)控, 從而導(dǎo)致了突變p53在腫瘤細胞的核內(nèi)積累。這一發(fā)現(xiàn)提示突變p53形成的四聚體可能具有與野生型p53 不同的轉(zhuǎn)錄激活功能。(4)2. “功能缺失”與“功能獲得”：功能缺失：一般來說，p53發(fā)生突變后, 會喪失野生型p53所具有的細胞周期阻滯、誘導(dǎo)凋亡發(fā)生、介導(dǎo)細胞衰老、維護基因組穩(wěn)定、錯配DNA 堿基修復(fù)等抑癌基因功能。功能獲得：突變型p

10、53 獲得了一系列類似癌基因特性的功能, 例如轉(zhuǎn)錄一系列靶基因加速癌癥進程、增強癌細胞化學(xué)耐藥性、阻止癌細胞凋亡的發(fā)生、抑制p63、p73活性等, 這一過程被稱為突變型p53的“功能獲得”。新近研究表明, 突變型p53 還抑制了MRN-ATM 通路活性。(2)3. 改變轉(zhuǎn)移能力：已有數(shù)據(jù)表明, p53+/、p53/小鼠高度腫瘤易感,具有在早期自發(fā)成瘤的表型。在其所生腫瘤中, 淋巴瘤和肉瘤占主體，但是在人類Li-Fraumeni 綜合征中較常見的上皮組織來源的瘤卻很少。而基因型為p53mutant/+、p53mutant/小鼠的腫瘤譜結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大改變, 上皮組織來源的瘤比例大幅提高，并伴有較高

11、的腫瘤轉(zhuǎn)移率，能更好地模擬人類Li-Fraumeni 綜合征。可見，mutp53 在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。(2)突變型p53獲得癌基因特性的機制研究者們認(rèn)為至少存在著兩種機制(圖2): 1.突變型p53可以作為具有癌基因活性的轉(zhuǎn)錄因子, 調(diào)控下游一系列靶基因的表達, 加速腫瘤的發(fā)生發(fā)展。這其中又包括兩種情況, mutp53獨立啟動的轉(zhuǎn)錄和與其他蛋白因子協(xié)同啟動的轉(zhuǎn)錄;2.突變型p53可以與p53家族的另外兩個重要抑癌基因 p63、p73相互作用, 抑制了p63、p73的活性。圖 2腫瘤治療新策略：腫瘤細胞內(nèi)重新激活p53小分子和多肽再激活p53絕大多數(shù)的P53突變是錯義突變, 這些突

12、變位點多發(fā)生在p53的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域, 導(dǎo)致突變的p53 不能與DNA 正常結(jié)合, 失去了轉(zhuǎn)錄激活能力,進而失去了腫瘤抑制的能力。后來科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，引入小分子或多肽與突變p53結(jié)合可以恢復(fù)其與DNA的結(jié)合功能。1.引入多肽實驗證明， 通過引入針對突變p53 R273H、R273C、R248Q、R282W 的C末端設(shè)計的多肽，通過其與突變蛋白的相互作用改變其構(gòu)象能恢復(fù)突變p53對特定序列的DNA結(jié)合能力，進而產(chǎn)生生長抑制或誘導(dǎo)凋亡。這一結(jié)果可能是因為該多肽穩(wěn)定了p53的核心折疊構(gòu)象, 加強了與DNA的結(jié)合能力。p53核心結(jié)構(gòu)域(DNA 結(jié)合區(qū))對p53發(fā)揮其抑癌作用起關(guān)鍵作用, 因此可以設(shè)想如

13、果能穩(wěn)定野生型p53的核心結(jié)構(gòu)域和校正突變p53的核心結(jié)構(gòu)域就能使其發(fā)揮抑癌作用。這一策略的構(gòu)想是找到一種配基, 能正確與突變p53核心結(jié)構(gòu)域結(jié)合， 并且能通過與突變p53的結(jié)合改變突變p53的核心結(jié)構(gòu)域，使它的折疊構(gòu)象向正確方向轉(zhuǎn)變。p53 蛋白的穩(wěn)定還與細胞內(nèi)的分子伴侶有關(guān),研究發(fā)現(xiàn)p5 能與Hsp40、Hsp70和Hsp90結(jié)合。未折疊的突變p53與Hsp70有高親和力，遠超過野生型p53，這一發(fā)現(xiàn)提示我們，Hsp蛋白可能穩(wěn)定了突變p53的未折疊構(gòu)象，因此阻止Hsp蛋白與突變p53的結(jié)合有可能使突變p53恢復(fù)折疊構(gòu)象。(4)2.引入小分子相比多肽來說, 小分子治療擁有更多優(yōu)勢，如不易引起

14、免疫排斥反應(yīng)，使用方便, 可靜脈注射或口服等, 因此尋找有效的小分子就顯得尤為重要。(5)對作用于突變p53的小分子的尋找有兩個主要途徑：蛋白分子水平分析和細胞水平效應(yīng)分析。前一種方法可以確認(rèn)突變p53蛋白與小分子作用后的蛋白變化和了解相應(yīng)的機制，但不能確定該小分子是否能進入細胞及是否有細胞毒性等；而后一種方法可以觀察到小分子作用后細胞的變化，是否能誘導(dǎo)細胞凋亡等，但卻不容易解釋詳細的分子機制。通過以上兩種方法， 目前找到了一些作用于突變p53的小分子化合物，如CP-31398、PRIMA-1、MIRA-1 等。CP-31398是在熱變性條件下，從大量,小分子中篩選出的能保護p53核心結(jié)構(gòu)域的

15、小分子，而PRIMA-1、MIRA-1 這兩個小分子則是通過篩選能引起表達突變p53的腫瘤細胞凋亡的小分子發(fā)現(xiàn)的。在體外, 這些小分子能激活p53的正常功能,誘導(dǎo)p53目的基因如p21、MDM2和PUMA 等的表達，而且CP-31398、PRIMA-1 還能在小鼠體內(nèi)抑制腫瘤生長。重組的腺病毒在腫瘤細胞中表達野生p53通過重組包含p53cDNA的腺病毒Advexin，在腫瘤細胞中表達野生p53進而激活p53途徑，抑制和清除腫瘤。選用Advexin載體是因為它能夠轉(zhuǎn)染多種細胞， 包括分化和未分化的細胞，并且不會整合到宿主基因組上，同時它能夠大批量生產(chǎn)，并且它的安全性已經(jīng)得到證實。抑制MDM2來重

16、新激活p531.p53-MDM2 復(fù)合物的空間晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)清楚，它們之間的疏水間隙被p53的3個氨基酸p53-Phe19, Leu26和Trp23占據(jù)，因此可以設(shè)想一些小分子模擬這3 個氨基酸和它們的方位來阻止MDM2-p53的相互作用。通過高通量分析和計算機模擬，發(fā)現(xiàn)了一些MDM2-p53阻斷分子，如Nutlins-3。在含野生p53并過度表達MDM2 的野生型和腫瘤衍生的細胞系中，低濃度的Nutlins-3就能有效激活p53途徑，誘導(dǎo)細胞周期抑制和細胞凋亡。2.以往的p53-MDM2抑制小分子多是根據(jù)他們之間的3個氨基酸p53-Phe19、Leu26 和Trp23設(shè)計的，而MI-63的設(shè)計

17、還加入了第4個氨基酸Leu22,該氨基酸對p53-MDM2結(jié)合有重要作用。(6)MI-63高度親和的結(jié)合MDM2上，抑制p53-MDM2 相互結(jié)合。MI-63表現(xiàn)出比Nutlins-3更強的p53-MDM2抑制能力，更強的促凋亡能力, 同時還發(fā)現(xiàn)MI-63與阿霉素有強協(xié)同作用。3.絕大多數(shù)的MDM2-p53 干擾小分子都是結(jié)合到MDM2上的來抑制MDM2-p53相互作用的，可看作MDM2 的抗體。但RITA不同，RITA 結(jié)合到p53N端，促進p53的積累，同時在體內(nèi)外抑制p53與MDM-2的相互作用,因此RITA促進了p53 下游基因的表達并能有效誘導(dǎo)凋亡，RITA 的腫瘤抑制能力是野生型p

18、53依賴的。(7)但這一解釋遭到了質(zhì)疑，最新的研究發(fā)現(xiàn)RITA 在一些含p53熱點突變的腫瘤治療中重新激活了p53 介導(dǎo)的細胞凋亡，也就是說RITA 并不是完全野生型依賴的。RITA 穩(wěn)定p53的機制還在研究中, Krajewski 通過NMR數(shù)據(jù)證明RITA并不是直接作用于p53 而是通過其他機制穩(wěn)定了p53。4參考文獻1童坦君.P53的抑癌原理及應(yīng)用前景J.生命的化學(xué)，1993,13(1):7-102李大虎, 張令強, 賀福初.突變p53研究進展J.遺傳，2008.06,30(6):697-7033閆毓秀, 張淑萍，滑靜.p53基因研究進展J.遺傳，2009.04,24(2):74-774陸思千, 賈舒婷, 羅瑛. 突變p5