1、實驗目的 掌握溶血空斑試驗檢測原理掌握溶血空斑試驗檢測原理 掌握溶血空斑的操作方法掌握溶血空斑的操作方法實驗原理溶血空斑實驗（溶血空斑實驗（plaque forming cell assay,PFC ） 體外檢測單個抗體形成細胞（體外檢測單個抗體形成細胞（B淋巴細胞）的一淋巴細胞）的一種方法。種方法。其原理是將綿羊紅細胞（其原理是將綿羊紅細胞（SRBCSRBC）免疫家兔或小鼠，）免疫家兔或小鼠，取家兔淋巴結或小鼠脾細胞制成細胞懸液，與一取家兔淋巴結或小鼠脾細胞制成細胞懸液，與一定量的定量的SRBCSRBC結合，在結合，在3737條件下免疫活性淋巴細條件下免疫活性淋巴細胞釋放出溶血素，在補體的參

2、與下，可溶解周圍胞釋放出溶血素，在補體的參與下，可溶解周圍的綿羊紅細胞，從而在每個抗體形成細胞周圍形的綿羊紅細胞，從而在每個抗體形成細胞周圍形成一個可見的溶血空斑。成一個可見的溶血空斑。一個空斑代表一個抗體形成細胞（即一個空斑代表一個抗體形成細胞（即B B細胞細胞 ），空斑的數量反映機體的體液），空斑的數量反映機體的體液免疫功能。免疫功能。 空斑大小表示抗體生成細胞產生抗體的空斑大小表示抗體生成細胞產生抗體的多少。由于溶血空斑試驗具有特異性高，多少。由于溶血空斑試驗具有特異性高，篩選力強，可直接觀察等優點，故可用篩選力強，可直接觀察等優點，故可用做判定免疫功能的指標，觀察免疫應答做判定免疫功能

3、的指標，觀察免疫應答的動力學變化，并可進行抗體種類及亞的動力學變化，并可進行抗體種類及亞類的研究。類的研究。 實驗材料與試劑 器材：平皿、器材：平皿、3737水浴箱、離心機、顯微水浴箱、離心機、顯微鏡鏡 試劑：試劑：SRBCSRBC懸液：取無菌脫纖維羊血，用懸液：取無菌脫纖維羊血，用NSNS或或PBSPBS離心洗滌離心洗滌3 3次，每次以次，每次以2000rpm2000rpm，5min5min，用，用PH7.2PH7.2的的PBSPBS（含（含CaCa2+2+、MgMg2+2+）懸成細胞濃度）懸成細胞濃度為為2.002.0010109 9個個/mL/mLHanksHanks液（含液（含CaCa

4、2+2+、MgMg2+2+ ）底層基（底層基（1.4%1.4%）和表層基（）和表層基（0.7% 0.7% ）：）：將瓊脂糖用將瓊脂糖用HanksHanks液配成液配成1.4%1.4%和和0.7%0.7%兩種兩種濃度。將表層基分裝于小試管中，每管濃度。將表層基分裝于小試管中，每管2ml2ml補體：新鮮豚鼠血清補體：新鮮豚鼠血清小牛血清：小牛血清：5656滅活滅活 30min30min實驗步驟免疫脾細胞懸液的制備免疫脾細胞懸液的制備小鼠免疫：每只小鼠經尾靜脈注入上述小鼠免疫：每只小鼠經尾靜脈注入上述SRBCSRBC懸懸液液2.00104個個/0.2ml0.2ml或者腹腔注射或者腹腔注射4.0010

5、8 個個/1ml1ml。單個脾細胞懸液的制備：將免疫后第四天的小單個脾細胞懸液的制備：將免疫后第四天的小鼠拉頸處死，解剖取出脾臟，放入鼠拉頸處死，解剖取出脾臟，放入PH7.2PH7.2的的PBSPBS中漂洗，去掉結締組織，加入適量的中漂洗，去掉結締組織，加入適量的PBSPBS，用鑷，用鑷子擠壓脾臟，稍靜置，吸上清液至離心管中，子擠壓脾臟，稍靜置，吸上清液至離心管中，2500r/min2500r/min離心離心5min5min，棄上清后，定量加入，棄上清后，定量加入PBSPBS液液1ml1ml，混勻，再用，混勻，再用PBSPBS液稀釋液稀釋1010倍（濃度約為倍（濃度約為5 510106 6個個

6、/ml/ml）（二）傾注底層瓊脂（二）傾注底層瓊脂 將將1.4%1.4%瓊脂凝膠加熱融化后，傾注于瓊脂凝膠加熱融化后，傾注于水平位置的平皿內，每皿水平位置的平皿內，每皿6ml6ml，凝固，凝固后，用前置后，用前置5555水浴鍋中預溫。水浴鍋中預溫。 （三）表層瓊脂的制備（三）表層瓊脂的制備 將將0.7%0.7%的瓊脂融化后，置于的瓊脂融化后，置于5555恒溫恒溫水浴箱中，依次加入以下試劑：水浴箱中，依次加入以下試劑： 20%SRBC 20%SRBC懸液懸液0.1ml0.1ml。 小牛血清小牛血清0.1ml0.1ml。 5.00 5.0010106 6/ml/ml脾細胞懸液脾細胞懸液0.1ml0

7、.1ml。 迅速混勻后，傾注于已鋪好底層瓊脂迅速混勻后，傾注于已鋪好底層瓊脂的平皿內，使之均勻鋪平凝固后，靜的平皿內，使之均勻鋪平凝固后，靜置約置約15min15min，放，放3737溫育溫育2h2h。 （四）加補體（四）加補體 從溫箱中取出平皿，每皿加入從溫箱中取出平皿，每皿加入1:51:5稀稀釋的新鮮豚鼠血清釋的新鮮豚鼠血清1ml1ml，繼續放，繼續放3737溫箱中溫育溫箱中溫育30min30min后取出，觀察溶血后取出，觀察溶血空斑。也可在室溫下放置空斑。也可在室溫下放置1h1h，44冰冰箱過夜，次日觀察結果。箱過夜，次日觀察結果。結果判定結果判定 觀察時，將平皿對著光亮處，觀察時，將平

8、皿對著光亮處，用肉眼或放大鏡觀察每個溶血空斑用肉眼或放大鏡觀察每個溶血空斑的溶血狀況，并記錄整個平皿中的的溶血狀況，并記錄整個平皿中的空斑數，同時求出每百萬個脾細胞空斑數，同時求出每百萬個脾細胞內含空斑形成細胞的平均數。內含空斑形成細胞的平均數。注意事項注意事項 對對SRBCSRBC的要求：因為的要求：因為SRBCSRBC既是免疫原，也是既是免疫原，也是靶細胞和指示細胞，故要求靶細胞和指示細胞，故要求SRBCSRBC應新鮮，洗滌應新鮮，洗滌不超過不超過3 3次，每次次，每次2 000r/min2 000r/min離心離心5min5min，細胞，細胞變形或脆性增大者均不能使用。變形或脆性增大者均

9、不能使用。2 2免疫所用免疫所用SRBCSRBC的數量：尾靜脈注射以的數量：尾靜脈注射以2.00104 個個/0.2ml為宜。腹腔注射為為宜。腹腔注射為4.00108 個個 /ml，用量小，如低于用量小，如低于1.00107個個/ml注射注射0.5ml，空斑形成極少；用量過大，超過，空斑形成極少；用量過大，超過2.50109個個/ml，不能形成空斑。，不能形成空斑。 3 3采取免疫脾的時間：無論是經尾靜脈還是腹采取免疫脾的時間：無論是經尾靜脈還是腹腔免疫，均以免疫后第四天取脾為宜，過早或腔免疫，均以免疫后第四天取脾為宜，過早或過晚空斑都形成極少。過晚空斑都形成極少。4 4脾細胞的活力：脾細胞的

10、活力： 為了保證脾細胞的活力，制為了保證脾細胞的活力，制備脾細胞過程中所用備脾細胞過程中所用PBSPBS（或（或HanksHanks液），最液），最好臨用時方從好臨用時方從44冰箱中取出，或整個操作過冰箱中取出，或整個操作過程應在冰浴中進行。程應在冰浴中進行。 5 5傾注平板的要求：底層要平，表層要把握好傾注平板的要求：底層要平，表層要把握好溫度。不要有氣泡，表層基要求混合均勻。溫度。不要有氣泡，表層基要求混合均勻。6 6補體的活力：補體活力的大小，對溶補體的活力：補體活力的大小，對溶血空斑的形成關系很大。如出現抗體或血空斑的形成關系很大。如出現抗體或補體的活力低下，將不能形成空斑。所補體的活力低下，將不能形成空斑。所以補體要新鮮，并宜將以補體要新鮮，并宜將3 3只以上豚鼠血清只以上豚鼠血清混合。試驗中加入混合。試驗中加入CaCa2+2+、MgMg2+2+是為了活化是為了活化補體。補體。7 7空斑計數：要求判讀準確，避免辨認空斑計數：要求判讀準確，避免辨認造成的誤差。遇可疑空斑時，應鏡檢，造成的誤差。遇可疑空斑時，應鏡檢，對肉眼結果進行核對。對肉眼結果進行核對。 所以器皿和各種試劑在加入表層基前均所以器皿和各種試劑在加入表層基前均需預溫。需預溫。 SRBCSRBC可大致計數，但脾細