1、常規抗血清制備方法 第一節第一節 常規抗血清的制備方法常規抗血清的制備方法一、動物的免疫二、抗血清的采集1、免疫動物的選擇2、抗原接種3、佐劑的應用動物的免疫動物的免疫免疫動物的選擇免疫動物的選擇種屬與品系經濟性“R”型與“H”型經驗性適配抗原接種抗原接種劑量：注射途徑：間隔與免疫時間：接種次數：佐劑的概念與種類佐劑的概念與種類概念：與抗原同時或先于抗原進入 機體，以提高抗原的免疫原 性的物質。種類：非免疫原性物質 免疫原性物質佐劑的作用機理佐劑的作用機理延長抗原的作用時間增強吞噬作用刺激抗原提呈促進細胞因子分泌誘導淋巴細胞分裂、增殖影響T細胞“極化”1、采集方法2、血清的分離與滅活抗血清的采

2、集抗血清的采集采集方法采集方法一次性采集多次性采集抗血清的分離與滅活抗血清的分離與滅活血清析出的溫度血清的滅活 第二節第二節 單克隆抗體的制備方法單克隆抗體的制備方法一、單克隆抗體與雜交瘤技術二、單克隆抗體的制備過程三、單克隆抗體的特性單克隆抗體與雜交瘤技術單克隆抗體與雜交瘤技術1、單克隆抗體2、雜交瘤技術表位A表位B表位C抗原克隆A克隆B克隆C多克隆抗體單克隆抗體單克隆抗體單克隆抗體 由一個識別單一抗原決定由一個識別單一抗原決定簇（表位）的簇（表位）的B細胞克隆所產細胞克隆所產生的同源抗體。生的同源抗體。雜交瘤技術雜交瘤技術 通過融合經免疫的小鼠脾細胞和建系小鼠骨髓瘤細胞，以獲得同時具有抗體

3、分泌功能和保持細胞永生性特征的雜交瘤細胞克隆。是獲取單克隆抗體的主要技術途徑。單克隆抗體制備過程單克隆抗體制備過程1、致敏淋巴細胞的準備2、骨髓瘤細胞的準備3、細胞融合4、選擇性培養5、抗體分泌細胞的篩選6、克隆化過程7、單克隆抗體的制取抗原致敏淋巴細胞骨髓瘤 細胞融合選擇性 培養抗體分泌細胞篩選克隆化單抗制取單抗純化單抗鑒定致敏淋巴細胞的準備致敏淋巴細胞的準備動物選擇：品系、年齡、性別、健康狀態抗原接種：方式體內、體外 劑量g 次數視抗原而定 間隔視抗原而定 佐劑視抗原而定收集時間：末次接種后72h骨髓瘤細胞的準備骨髓瘤細胞的準備細胞株處于良好的生長狀態細胞株保持HGPRT缺陷狀態細胞融合細

4、胞融合方式：物理、化學、生物PEG融合要點：（見圖）致敏淋巴細胞骨髓瘤細胞離心 1000rpm 10min50%PEG 1ml培養液 10ml離心 1000rpm 7min37。C搖動、由慢漸快1min、靜止加入HAT培養液懸浮細胞，置于培養孔內選擇性培養選擇性培養隨機融合后的細胞類型HAT選擇培養原理隨機融合后的細胞類型隨機融合后的細胞類型細胞組合 HGPRT 生長狀態淋巴細胞 + 骨髓瘤 + 長期生長淋巴細胞 + 淋巴細胞 + 短期生長骨髓瘤 + 骨髓瘤 不能生長未融合淋巴細胞 + 短期生長未融合骨髓瘤 不能生長HAT選擇培養原理選擇培養原理核苷酸從頭合成途徑（de novo synthe

5、sis）核苷酸補救合成途徑（salvage synthesis）HAT核苷酸DNA氨基碟呤（A）次黃嘌呤（H）胸腺嘧啶核苷（T）抗體分泌細胞的篩選抗體分泌細胞的篩選對篩選方法的要求： 多大量樣品一次檢測 快迅速取得檢測結果 準檢測結果可靠性高 靈檢測方法靈敏度高常用篩選方法： ELISA、RIA、CDC、IFA等克隆化過程克隆化過程概念：建立單一細胞克隆方法：有限稀釋法克隆建立的標準：連續兩次以上100%陽性孔飼養細胞：同品系小鼠腹腔、胸腺、脾細胞有限稀釋法有限稀釋法計數103/ml102/ml10/ml孔單克隆抗體的制取單克隆抗體的制取制取方式：體外培養罐法體內腹腔接種純化：鹽析、層析、制備

6、型HPLC鑒定：特征鑒定Ig類型、親和力、效價、特異性決定簇鑒定是否針對同一決定簇多抗與單抗制劑的比較多抗與單抗制劑的比較 多抗 單抗 單抗 （血清） （腹水） （培養上清）特異性抗體含量（mg/ml） 無關Ig含量（mg/ml） 10 0.5-1 其他血清蛋白 大量 極少 均一性 + +特異性 多決定簇 單決定簇 單決定簇穩定性 較好 略差 略差重復性 差 好 好單克隆抗體的特性單克隆抗體的特性1、理化性狀高度均一2、抗原結合性高度特異3、生物活性高度單一 第三節第三節 抗體的純化與鑒定抗體的純化與鑒定一、抗體純化的目的與方法二、純化抗體的鑒定與保存抗體純化的目的抗體純化的目的1、去除雜蛋白2、去除雜抗體3、去除非同類抗體抗體純化的方法抗體純化的方法1、鹽析、層析技術2、抗原吸附純化抗體的鑒定純化抗體的鑒定1、多克隆抗體的鑒定2、單克