1、survivin反義寡核苷酸誘導胃癌細胞凋亡及對多西他賽的增敏作用         10-11-01 09:07:00     作者：劉超俠 董薇 孔慶兗    編輯：studa20【摘要】  目的 探討生存素(survivin)反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide, ASODN)對人胃癌細胞株SGC7901的凋亡誘導、對多西他賽的化療增敏作用。方法 設計合成特異性靶向survivin ASODN。

2、將胃癌細胞株分為空白對照組(Sham組)、單純脂質體對照組(Lip組)、正義寡核苷酸轉染對照組(Lip-SODN組)、ASODN轉染組(Lip-ASODN組)。轉染48 h后，Western blot法檢測各組細胞survivin表達情況,流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率,MTT法檢測轉染細胞對多西他賽的敏感性。結果 脂質體介導survivin ASODN轉染后的胃癌細胞survivin蛋白表達明顯下降，細胞凋亡率明顯高于各對照組(P<0.05)，對多西他賽的IC50值明顯低于各對照組(P<0.05)，細胞生長抑制率明顯高于各對照組(P<0.05)。結論 survivin ASO

3、DN轉染胃癌細胞能下調survivin蛋白表達,誘導胃癌細胞凋亡,抑制細胞增殖,增強多西他賽化療敏感性。 【關鍵詞】  生存素;反義寡核苷酸;胃癌細胞;凋亡;多西他賽;增敏作用Abstract:Objective To investigate the effects of survivin antisense oligonucleotide (ASODN) on the apoptosis and chemosensitivity to docetaxel of the human gastric carcinoma cell line SGC7901. Methods ASODN

4、targeting survivin was designed and constructed. The cultured gastric carcinoma cells were divided into the sham group, lipofectin group, sense oligonucleotide (SODN) group and antisense oligonucleotide (ASODN) group. After transfection for 48 h, the expression level of survivin in each group was de

5、tected by Western blot; the apoptotic rate (AR) was examined by flow cytometry; and the sensitivity of SGC7901 cells to docetaxel was determined by MTT.Results The expression of survivin in SGC7901 cells was downregulated after transfection with survivin ASODN; The AR of ASODN group was significantl

6、y higher than that of the other groups (P<0.05); IC50 of the transfected cells to docetaxel had a significant difference as compared to other groups (P<0.05), and the inhibitory rate (IR) of ASODN group was significantly higher than that of other groups (P<0.05).Conclusion The ASODN transfe

7、ction of gastric carcinoma cells can downregulate the survivin expression, induce cell apoptosis, inhibit cell proliferation and enhance the cell sensitivity to docetaxel, which may help to reverse drug resistance.Key words： survivin; antisense oligonucleotide; gastric tumor cell; apoptosis; docetax

8、el; chemosensitivity生存素(survivin)屬于凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族中的新成員，它可以通過有絲分裂促進細胞增殖，抑制細胞凋亡。凋亡是化療藥物誘導腫瘤細胞死亡的主要模式，survivin在調節腫瘤細胞凋亡敏感性方面起著核心作用。本實驗采用脂質體介導survivin反義寡核苷酸( survivin ASODN )轉染人胃癌細胞SGC7901，以封閉survivin基因的表達，觀察其對胃癌細胞SGC7901的凋亡誘導以及對化療藥物多西他賽的化療增敏作用。1 材料和方法1.1 材料 胃癌細胞株SGC7901購于

9、中國科學院細胞生物研究所。survivin反義寡核苷酸、錯配寡核苷酸(與反義寡核苷酸相同堿基組成、不同排列順序)由上海生工生物工程公司合成，兩端3個堿基經硫代修飾以對抗核酸酶的降解;反義寡核苷酸為5-CCC AGC CTT CCA GCT CCT TG-3，錯配寡核苷酸為5-GCC ACT CCT CGA CTC TCG TC-3。陽離子脂質體Lipofectin購于Invitrogen公司。survivin抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標記的第二抗體購于Santa Cruz公司，RPMI 1640 購于Invitriogen公司，小牛血清購于杭州四季青公司，多西他賽購于Aventis Pha

10、rma Dagenham公司。1.2 方法1.2.1 細胞株培養 人胃癌細胞株SGC7901用含10%小牛血清的RPMI 1640培養基，在37、5%CO2的飽和濕度條件下培養。1.2.2 細胞分組及轉染 取對數生長期的SGC7901，傳代接種于6孔培養板內，調整細胞密度，使每孔的細胞數為3×105，常規條件下培養24 h，顯微鏡下觀察，約80%細胞融合時開始實驗。設置空白對照組(Sham組)、單純脂質體對照組(Lip組)、正義寡核苷酸轉染對照組(Lip-SODN組)和反義寡核苷酸轉染組(Lip-ASODN組)，每組設3個復孔。細胞轉染過程按轉染試劑盒說明書進行，轉染12、24、48

11、 h后收集各組細胞用于后續實驗。1.2.3 Western blot法檢測細胞survivin蛋白表達 將預冷至4的勻漿緩沖液加入到經HBSS漂洗的培養細胞中,冰上刮取細胞，收集，冰浴中超聲破碎(10 s×3)，測定蛋白濃度,以100 g/孔上樣,15% SDS-PAGE凝膠電泳分離,通過電轉移法將蛋白質從SDS-PAGE凝膠轉移至硝酸纖維素膜。將硝酸纖維素膜置封閉液中室溫孵育3 h后,加入一抗(兔抗人生存素抗體,工作濃度為1500)4孵育過夜,TBST充分漂洗(5 min×3次),加入HRP標記的二抗(羊抗兔IgG-AP,工作濃度為1500)37作用2 h,TBST充分漂

12、洗(5 min×3次),以NBT/BCIP顯色,觀察結果。1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 將收獲的各組細胞制成單細胞懸液,加入預冷的70%冰乙醇,-20內固定24 h,加RNA酶(終濃度為50 mg/L)37反應1 h，再加入碘化丙啶溶液(質量濃度100 mg/L)避光染色30 min后，在流式細胞儀上檢測,應用相應程序軟件進行資料的處理和分析。1.2.5 MTT 法檢測各組細胞對多西他賽的敏感性 收獲的各組細胞用含10%小牛血清的RPMI 1640重懸,倒置顯微鏡計數細胞,調整細胞密度為1×105/L,并接種于96孔板內,每組設置7個復孔，其中1孔作調零用(空白對照

13、組)，另6孔依次加入0、1、10、20、50、100 g/L的多西他賽，再各設6個復孔。常規條件下培養48 h,每孔加入5 g/L的MTT 20 l,繼續培養4 h,傾盡上清。每孔加入二甲基亞砜0.1 ml,搖床上搖動約15 min以充分溶解,用酶標儀在波長570 nm處檢測各孔光密度值(D值),計算細胞生長抑制率(IR)=(1-實驗組平均D值)/空白對照組平均D值×100%。1.3 統計學處理 采用SPSS 10.0軟件進行數據處理，應用方差分析、q檢驗行差異顯著性檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。2 結 果2.1 ASODN轉染后SGC7901細胞survivin蛋白表

14、達變化 ASODN轉染組survivin蛋白表達下調,與各對照組比較差異有統計學意義(P<0.05);各對照組survivin蛋白表達無明顯改變，各對照組間差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。與其他組比較：#P<0.052.2 ASODN轉染對細胞凋亡率的影響 ASODN轉染可誘導SGC7901細胞凋亡, ASODN作用48 h的胃癌細胞，在G1期前出現亞二倍體凋亡峰，對照組未見凋亡峰。ASODN轉染組細胞凋亡率明顯高于其他組(P<0.05),而各對照組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1、圖2。2.3 ASODN轉染后胃癌細胞對多西他賽敏感性的檢測 各組細胞隨多西他賽藥物濃度提高，細胞生長抑制率均呈上升趨勢，但ASODN轉染的SGC7901細胞生長抑制率明顯高于其他各對照組(P<0.05)，Sham、Lip 和 Lip-SODN 對照組間差異無統計學意義(P&