1、對外周血單個核細胞分離方法探討韓亞萍 劉源 章莉莉 劉婷 李軍 黃祖瑚 2004-7-24 17:06:00 中華現代臨床醫學雜志 2003年11月 第1卷 第9期【摘要】 目的 探討外周血單個核細胞（PBMC）的不同分離方法對分離效果、貼壁能力以及淋巴細胞的增殖活性的影響。方法 取肝素抗凝血，分別用羥乙基淀粉（hydrixyethylstarch，HES）自然沉降法、HES離心沉淀法、Ficoll密度梯度離心法三種方法分離單個核細胞，直接進行貼壁計數及多種細胞因子誘導的殺傷細胞（Cytokine-induced killer，CIK）培養。結

2、果 HES自然沉降法、HES離心沉淀法、Ficoll密度梯度離心法分離的PBMC回收率分別為86.4%、86.0%、85.1%。結論 羥乙基淀粉離心沉淀法可有效地分離PBMC。關鍵詞 羥乙基淀粉 淋巴細胞分離液 單核細胞Study on the methods of separating peripheral blood mononuclear cellsHanYaping，Liu Yuan，Zhang Lili，et al.Deparment of Infectious Diseases，The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical Uni

3、versity，Nanjing210029.【Abstract】 Objective To investigate the difference among three protocols of isolating peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）through observing the recovery rate，the adherent ability and lymphocytes proliferation activity of the isolated PBMCs.Methods Use three different isola

4、tion protocols，HES（hydrixyethylstarch）sedimentation method，HES centrifugation method and Ficoll density gradient centrifugation，to isolate PBMCs from healthy donors.Then compare these isolation protocols through observing the recovery rate of PBMCs，the number of plastic-adherent cells and the cytoki

5、ne-induced killer cells proliferation.Results The recovery rate of PBMCs is86.4%by HES sedimentation method，83.7%by HES centrifugation and sedimentation method and85.1%by Ficoll density gradient centrifugationmethod separately.Conclusion Our observation provide evidence that HEScentrifugation method

6、 could efficiently isolate PBMCs from human peripheral blood.Key words hetastarch ficoll monocyte外周血單個核細胞分離效果直接影響細胞培養結果，經典的Ficoll密度梯度常用于少量血液分離，而在血液較多時則須分成許多離心管，重復地開放操作增加了污染機會。為此，我們用HES離心沉淀法代替Ficoll密度梯度離心法分離PBMC，對不同方法獲取PBMC的貼壁能力和CIK細胞增殖活性等作一較為系統的探討。1 材料和方法1.1 材料 外周血:健康成人外周血10份。Ficoll:上海試劑二廠，分子量400000

7、。6%HES:DUPONT公司生產，分子量480000。1.2 方法1.2.1 外周血單個核細胞的分離 HES自然沉降法 1 :即肝素抗凝血與6%HES按5:1混合，自然沉降60min，取上層液400×g離心10min，以RPMI1640洗兩遍備用。HES離心沉淀法:分別將抗凝血與HES12:1、7:1、6:1、5:1、3:1、2:1，使HES終濃度為0.5%、0.85%、1.0%、1.2%、2.0%和3.0%條件下2060×g離心10min，取上層液400×g離心10min，以RPMI1640洗兩次備用。Ficoll密度梯度離心法 2 :肝素抗凝血先與RPMI1

8、640培養液1:1混合，再加等量淋巴細胞分離液600×g離心20min，小心吸取單個核細胞層，以RPMI1640洗兩遍備用。1.2.2 PBMC的處理 將不同分離方法獲取的PBMC計數后重懸于完全培養基中，分別加入24孔培養板，每孔4×10 6 細胞，37，5%CO 2 培養2h后吸取培養上清，用RPMI1640輕輕洗滌培養孔3次以去除非貼壁細胞。收集貼壁細胞計數并用熒光素標記的單克隆抗體通過熒光激活細胞分離器（FACS Vantage SE）鑒定。懸浮細胞用完全培養基調整細胞濃度至1×10 6 /ml，補充適量的CD3單抗、rh-IFN、IL-2等，共同培養多種

9、細胞因子誘導的殺傷細胞（CIK），每3天換液1次并計數，第10天收獲細胞，計算增殖倍數，同時以熒光素標記的單克隆抗體鑒定細胞類型。1.2.3 統計學方法 應用SAS6.12統計軟件進行方差分析、t檢驗。數值以平均數±標準差表示。2 結果2.1 不同分離方法PBMC回收率 HES終濃度在0.5%、0.85%、1.0%、1.2%、2.0%和3.0%條件下進行離心沉淀和自然沉降，結果顯示HES終濃度1.0%時PBMC回收率最高，為此我們確定HES終濃度1.2%為最后實驗濃度。用HES離心沉淀法和自然沉降法分離的PBMC總數相近，與傳統的Ficoll密度梯度離心法比較也無統計學差異（P>

10、;0.05），結果見表1。2.2 不同分離方法PBMC貼壁能力 HES自然沉降法、HES離心沉淀法、Ficoll分離法其CD14 + 細胞FACS檢測平均百分率分別為38.69%、68.70%、64.54%，HES自然沉降法明顯低于后兩法（P<0.01），HES自然沉降法中含有較多的CD3、CD19、CD56細胞見圖1。2.3 不同分離方法PBMC增殖活性 HES自然沉降法、HES離心沉淀法和Ficoll分離法所獲得PBMC，其CIK細胞增殖能力接近，第10天略有差別但無統計學差異（P>0.05）。見圖2。圖1 不同分離方法PBMC的貼壁能力略圖2 不同分離方法CIK細胞增殖能力的

11、比較略表1 不同分離方法PBMC回收率略3 討論分離PBMC是一項常規工作，傳統的是采用Ficoll密度梯度離心法，Ficoll是一種粘性強的液體，其比重為1.077，在一定離心力的作用下，比重大于淋巴細胞的紅細胞及多核粒細胞等沉淀于分離液的底層，單個核細胞在分離液的界面上。操作時需將抗凝血作適當稀釋，比較適用于少量血液的分離，在血量較多時要分成數管進行離心，十分不便，而且重復多次地開放性操作也增加了污染機會。HES是一種血漿代用品 3 ，原料來自于天然綠色植物玉米，由高分子量支鏈淀粉經降解、羥乙基化并進一步加工處理后制成。HES與紅細胞膜上的負電荷結合，使紅細胞彼此以凹面相貼，重疊在一起的紅

12、細胞下沉阻力減少，紅細胞與血漿及單個核細胞形成清晰的界面。抗凝血與終濃度為1%2%的HES混合后經低速離心可加快紅細胞的下沉，便于吸取含單核細胞的血漿層，使PBMC的分離過程簡單化，有利縮短工作時間，提高工作效率。此外，用HES分離PBMC也可在封閉系統中即血袋中進行 1 ，非開放性操作可減少污染機會。與Ficoll法相比HES離心沉淀法除簡化了操作外，也減少了耗材，降低了試驗成本 4 。Denning 5 等用HES沉降法分離臍血單個核細胞發現，臍血單個核細胞的回收率可受分離前臍血放置時間和溫度的影響。我們將新鮮采集的血液與HES混勻后常溫（2225）靜置60min獲取的PBMC，其細胞活率

13、及貼壁能力都低于HES離心沉淀法，不規則細胞形態增加，是否與細胞在相對高濃度的HES中浸泡時間過長有關，還有待于觀察。將肝素抗凝血與HES在離心管中按最適比例混勻后 直接60×g離心10min，所得到的細胞數量與其他方法相近（見表1），無統計學差異，而形態學和貼壁能力明顯好于HES自然沉降法（P<0.01）。HES有高、中、低三種分子量，不同的分子量其分離效果各有差異 6。因此，選擇合適的HES濃度和分子量可以確保分離效果。總之，在獲取PBMC時應根據血量多少和實驗室的條件來選擇不同的分離方法。本實驗室用6%HES離心沉淀法分離的外周血單個核細胞回收率為86.0%，活細胞在97

14、%以上。在綜合細胞純度、細胞回收率、細胞活力以及操作的難易程度等因素，筆者認為HES離心沉淀法不失為分離PBMC首選的方法之一。參考文獻1 Rubinsten P，Taylor PE，Scaradavou A，et al.Unrelated placental blood forbone marrow reconstitution:organization of the placental blood program.Blood Cells，1994，20:587-600.2 北京醫學院微生物學教研組編.實驗免疫學.北京:人民衛生出版社，1980，435-436.3 Forster H.Physical and chemical properties of hydroxyethylstarch.Plasma Volume Expansion，1992，105-121.4 Rubinstein P，Dobrila L，Rosenfield RE，et al.Processing and cryopreservation of placental/umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution.Proc Natl Acad Sci