1、激活的ACM對魚藤酮誘導的細胞氧化損傷的抑制作用(一)    作者：劉輝 尹芳秋 高秋菊 郭魁亮 陳盛鵬 劉杰 賀森【摘要】 目的 觀察激活的星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液(ACM)在魚藤酮所致PC12細胞氧化損傷過程中的作用。方法 收集激活的ACM，加入到魚藤酮染毒PC12細胞中，觀察其對染毒神經(jīng)元胞內(nèi)丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)活性的影響，并檢測細胞活性氧(ROS)水平和線粒體呼吸鏈復合物的活性變化。結(jié)果 ACM可明顯降低染毒PC12細胞MDA和ROS水平;與完全培養(yǎng)基處理比較，ACM能有效增加染毒神經(jīng)元SOD

2、和GSHPx的合成和釋放，保護和提高抗氧化酶活性。結(jié)論 ACM能有效抑制魚藤酮誘導的PC12細胞氧化損傷。 【關鍵詞】 星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液;魚藤酮;氧化損傷研究發(fā)現(xiàn)，長期接觸農(nóng)藥魚藤酮是引起帕金森病(PD)等神經(jīng)退行性疾病的重要環(huán)境誘發(fā)因素之一1。魚藤酮屬線粒體抑制類農(nóng)藥，由其引發(fā)的線粒體功能障礙及氧化應激與多巴胺能神經(jīng)元受損密切相關2，而線粒體功能障礙主要原因是復合物活性被抑制。星形膠質(zhì)細胞是體內(nèi)產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)因子的主要細胞，激活的星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液(ACM)中含有神經(jīng)生長因子和膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等多種神經(jīng)營養(yǎng)成分3。本研究應用睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)激活星形膠質(zhì)細胞，收集ACM

3、處理正常及不同濃度魚藤酮染毒的PC12細胞，觀察ACM對魚藤酮誘導的神經(jīng)元氧化損傷的保護作用，為闡明星形膠質(zhì)細胞在神經(jīng)退變過程中的作用提供理論依據(jù)。1 材料與方法1.1 主要試劑和儀器 魚藤酮(純度97.6%)、DCFDA購自Sigma公司，DMEM/F12培養(yǎng)基購自Gibco公司，睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子購自Peprotech公司，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)活性測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所;MPF4熒光分光光度計購自Hitach公司，激光共聚焦顯微鏡購自Leica公司。1.2 星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)及ACM收集 SD新生大鼠斷頭取中腦組織，按照Mc

4、Carthy4所述方法分離和純化星形膠質(zhì)細胞，經(jīng)3次傳代后常規(guī)免疫組化GFAP染色鑒定。用含有CNTF(40 ng/ml)的DMEM/F12無血清培養(yǎng)基孵育12 h，收集培養(yǎng)液，4，4 000 r/min離心5 min，取上清即獲得ACM。1.3 染毒PC12細胞內(nèi)MDA、SOD和GSHPx活性測定 PC12細胞接種于12孔板中，于對數(shù)生長期加入魚藤酮工作液處理，隨機分成對照組、0.1、0.5、1.0 mol/L魚藤酮組，各實驗組分別用完全培養(yǎng)基和ACM進行處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，按試劑盒說明書操作進行活性檢測。1.4 染毒PC12細胞線粒體活性氧簇(ROS)的檢測 PC12細胞干預和分組同

5、上，用100 mol/L DCFDA避光孵育30 min，經(jīng)PBS漂洗后，激光共聚焦顯微鏡記錄各孔熒光強度(激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長530 nm)，熒光強度與ROS水平成正比，增加的熒光強度即被認為是增加的活性氧。1.5 染毒PC12細胞線粒體復合物活性的檢測 PC12細胞干預和分組同上，將處理后的細胞用預冷的PBS漂洗2次，此后加入預冷的8 mg/ml毛地黃皂苷溶液，冰浴10 min，以10 000 r/min，4，離心5 min，棄上清，立即用100 l氨基乙酸緩沖液溶解，再加入10%十二烷基麥芽苷溶液20 l，冰浴5 min，以20 000 r/min，4，離心30 min，上清液

6、蛋白質(zhì)定量后取樣品10 l進行線粒體復合物活性測定5，重復5次，取平均值。1.6 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)用x±s表示，采用SPSS11.0軟件進行組間t檢驗。2 結(jié) 果2.1 星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)、純化和鑒定 分離培養(yǎng)并純化的星形膠質(zhì)細胞經(jīng)GFAP免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)至第三代的星形膠質(zhì)細胞純度可達95%以上，符合實驗設計需求。2.2 ACM對染毒PC12細胞內(nèi)MDA、SOD和GSHPx活性的影響 用完全培養(yǎng)基處理的染毒PC12細胞內(nèi)MDA含量顯著增加，SOD和GSHPx活性隨染毒劑量的增大而隨之下降。與完全培養(yǎng)基處理比較，ACM培養(yǎng)染毒神經(jīng)元后，各實驗組MDA含量明顯下降(P0.01)

7、;0.1和0.5 mol/L魚藤酮組SOD和GSHPx活性顯著升高(P0.05)，見表1。2.3 ACM對染毒PC12細胞ROS水平的影響 完全培養(yǎng)基處理的染毒PC12細胞ROS熒光強度明顯增強，而與之比較，ACM培養(yǎng)的0.5和1.0 mol/L 魚藤酮組PC12細胞ROS平均熒光強度顯著降低(P0.05)，見表2。2.4 ACM對染毒PC12細胞線粒體復合物活性的影響 線粒體復合物活性隨染毒劑量的增大明顯降低。與完全培養(yǎng)基處理比較，ACM培養(yǎng)染毒神經(jīng)元后，各實驗組線粒體復合物活性增強，但差異不顯著，見表2。表1 ACM對染毒PC12細胞MDA、SOD和GSHPx活性的影響與完全培養(yǎng)基組比較:

8、1)P0.05,2)P0.01;下表同表2 ACM對染毒PC12細胞ROS和復合物活性的影響3 討 論PD是一種中老年人常見的進行性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,其主要病理特征是黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元顯著缺失，從而導致紋狀體多巴胺含量降低6，但其確切發(fā)病機制尚不完全清楚。近年來的研究表明，活性氧和氧化應激在神經(jīng)元退變中起著重要作用7。魚藤酮抑制線粒體復合物活性，引起線粒體活性氧簇(ROS)水平升高，進一步加重機體氧化損傷。而線粒體是細胞對氧化應激最敏感的細胞器，自由基又可造成線粒體損傷，如此形成惡性循環(huán)，最終導致細胞死亡。本實驗發(fā)現(xiàn)，魚藤酮染毒PC12細胞線粒體復合物活性顯著降低，ROS水平則高于正常

9、對照組。表明魚藤酮通過阻抑復合物的電子傳遞，造成電子逃逸并與細胞內(nèi)O2反應生成O2，后者進一步在細胞內(nèi)代謝生成H2O2和OH-，引起細胞氧化應激反應。經(jīng)ACM處理PC12細胞后，0.5和1.0 mol/L 魚藤酮組細胞ROS水平明顯降低，而線粒體復合物活性未顯著增強。表明ACM并未明顯改善染毒神經(jīng)元線粒體復合物的抑制水平，但可能含有清除活性氧的抗氧化劑、抗氧化酶成分，或者ACM中某種或某些成分能誘導神經(jīng)元細胞內(nèi)抗氧化酶基因的表達。MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其含量高低反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度。GSHPx屬于清除自由基的酶促防御系統(tǒng)，是細胞抗氧化酶系統(tǒng)中的主要成員。SOD對維持機體氧化與抗氧化的

10、平衡起到至關重要的作用，它能迅速清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷，其活力大小反映了細胞抗氧化損傷的能力。本實驗結(jié)果顯示，魚藤酮染毒PC12細胞SOD和GSHPx活力均顯著降低，清除自由基能力下降，進而導致生物膜中的多不飽和脂肪酸過氧化反應和脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物MDA含量增加，引起細胞損傷。然而，經(jīng)ACM處理PC12細胞后，0.1和0.5 mol/L魚藤酮組SOD和GSHPx活性顯著升高，各實驗組MDA含量明顯下降。進一步證實星形膠質(zhì)細胞通過分泌細胞因子、過氧化氫酶和還原型谷胱甘肽(GSH)等多種蛋白質(zhì)，為周圍神經(jīng)元提供合成GSH的前體物質(zhì)，防止氧化應激導致的細胞死亡。近年來，星形膠質(zhì)細胞在神

11、經(jīng)退變性疾病中的作用日益受到人們的重視。有學者認為，在病理條件下，功能改變的星形膠質(zhì)細胞可能是PD等神經(jīng)退行性疾病發(fā)生、發(fā)展的始動因素或促進因素8。星形膠質(zhì)細胞表現(xiàn)出一定的抗氧化功能，但激活的星形膠質(zhì)細胞亦能分泌大量的NO及其他有毒物質(zhì)，刺激活性氧的生成，對神經(jīng)元生存起毒性作用。因此，設法促進星形膠質(zhì)細胞的保護功能，抑制其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不利影響，是今后的研究方向之一?！緟⒖嘉墨I】1 何德富，張 貝,王 鍵，等.魚藤酮和噠螨靈慢性暴露對大鼠的神經(jīng)毒性作用J.中國老年學雜志，2005;25(9):1099101.2 Claudia MT，Todd B，Sherer J,et al.Rotenon

12、e induces oxidative stress and dopaminergic neuron damage in organotypic substantia nigra culturesJ. Mol Brain Res，2005;134(6)：10918.3 嚴稽文，黃其林.星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液對缺氧損傷神經(jīng)元的保護作用J.神經(jīng)解剖學雜志，2007;23(3)：27782.4 Mc Carthy KD，de Vellis J.Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat

13、cerebral tissueJ.J Cell Biol，1980;85(3)：890902.5 Mazzio EA，Soliman KF.Effects of enhancing mitochondrial oxidative phosphorylation with reducingequivalents and ubiquinone on 1methyl4phenylpyridinium toxicity and complex IIV damage in neuroblastoma cellsJ.Biochem Pharmacol，2004;67(6)：116784.6 董兆君.魚藤酮的多巴胺神經(jīng)元毒性和帕金森病J.國外醫(yī)學·神經(jīng)病學與神經(jīng)外科學雜志，2001;28(5)：35760.7 Nicholls DG.Mitochondrial dysfunction and glutamate excitotoxicity studied in primary neuronal