1、    紅景天甙對缺氧狀態下兔肺動脈平滑肌細胞增殖 和c-fos、c-myc原癌基因表達的影響        摘要目的：研究紅景天甙(salidroside, Sal)對缺氧( 2%3%)狀態下兔肺動脈平滑肌細胞(PASMC)增殖、DNA合成、細胞周期和c-fos,c-myc 原癌基 因表達的影響。方法：應用細胞培養、四唑鹽比色試驗(MTT)、3H -胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)摻入、細胞周期測定和斑點雜交的方法。結果：發現缺氧24 h可直接刺激PASMC，使MTT

2、之OD值增加95%(P0.05)，3H-T dR的摻入量增加140%(P0.01)；在缺氧的PASMC培養液中加入Sal(1200 g/mL)可抑 制缺氧的這種促增殖作用，PASMC的MTT之OD值與3H-TdR摻入量與缺氧組相比顯著 下降(P0.05)；流式細胞分析顯示缺氧24 h PASMC G2/M期細胞比例比常氧組明顯 增 多(P0.01),G0/G1期細胞比例明顯減少(P0.05)，與缺氧組相比Sal可增 多PASMC G0G1期細胞比例，減少G2M期細胞比例(P0.05)；缺氧可促 進c-fos,c-myc原癌基因表達，該效應可被Sal所抑制。結論：紅 景天甙可抑 制缺氧所致的PA

3、SMC增殖、DNA合成、進入G2/M期的細胞比例和c-fos,c-myc原癌 基因表達。主題詞低氧；肺動脈；肌，平滑；基因-fos; 基因-myc; 原癌基因 Effects of salidroside on the proliferation and c-fos, c-myc oncogene expression ofrabbit pulmonary artery smooth muscle cell s under hypoxiaZHAO He-Ling, LIN Shu-Xin, JIA Bin, ZHANG Li-Li, ZHANG Shi-Fan?Department of Pa

4、thophysiology, Fourth Military Medical University, Xian(710032)?Lanzhou General Hospital Abstract AIM：To investigate the effects of salidroside on the proliferation, DNA synthesis, cell cycle and c-fos, c-myc oncogene expre ssion of rabbit PASMC(pulmonary artery smooth muscle cell) under hypoxia. ME

5、THODS ：Techniques of cell culture, M TT test, 3H-TdR incorporation, flowcytometric DNA analysis and Dot blot wer e used. RESULTS： OD value of MTT and 3H-TdR i ncorporation to PASMC increased significantly by 95% (P0.05) and 140%( P0.01) respectively after 24 h hypoxia, and salidroside(1 200 g/mL) co

6、uld inhibit these effects induced by hypoxia(P0.05); Flowcytometric DNA ana lysis revealed that hypoxia induced significant enhancement of G2/M phase of PASMC (P0.01) and decreased G0G1 phase of PASMC(P0.05); While salidroside could reverse these effects (P0.05); hypoxia stimulate d c-fos, c-myc onc

7、ogene expression of PASMC, and the effect could be inh ibited by salidroside. CONCLUSION：Salid roside inhibited the proliferation, the cell proportion of G2M phase, DN A synthesis and c-fos, c-myc oncogene expression of PASMC induced by hy poxia.MeSHAnoxia; Muscle, smooth; Pulmonary artery; Genes, f

8、os; Ge nes, myc; Oncogenes缺氧性肺動脈高壓形成的主要因素有缺氧性肺動脈血管收縮和缺氧性 肺動脈壁構型重建(remodeling)，而肺動脈平滑肌細胞的增殖是缺氧性肺動脈壁構型重建的 一個重要環節1。影響PASMC增殖的因素很多，如缺氧、血管緊張素-、內皮素 、張力2等。藥用植物紅景天具有抗缺氧、提高機體對高原的適應能力 等 作用，在我國西北、西南高原缺氧地區被用于防治高原適應不全癥3，并取得滿 意效果，但對其作用機理尚缺乏研究。本試驗應用細胞培養、四唑鹽比色試驗、3H -TdR摻入、流式細胞儀和斑點雜交等方法研究缺氧狀態下SAL對兔PASMC增殖、DNA合成、細 胞周

9、期和c-fos,c-myc原癌基因表達的影響，探討其在防治缺氧造成的肺動脈壁結 構改變和肺動脈高壓中的可能作用機制。材料與方法(一)實驗動物：純種新西蘭幼兔(出生1個月，體重400600 g)，由本校動物實驗中心提供 。(二)主要試劑和藥品：RPMI-1640培養基購自GIBCO公司；小牛血清購自杭州四季青生物工程 材料研究所，批號9610003； 胰蛋白酶、MTT(噻唑藍)購自Sigma公司；3H-TdR購自 上海原子能科學研究院，比度7.4×1011Bq/mmol、放射性濃度3.7×107 Bq/m L；c-fos,c-myc原癌基因探針購自華美生物試劑公司；紅景天甙由

10、蘭州軍區總醫院 提 供，根據Saratikov法提取；PPO購自FLUKA公司；POPOP、DMSO為上海化學試劑一廠產品。(三)實驗方法：1.PASMC的培養和細胞同步化方法：新西蘭幼兔麻醉后，無菌取出肺主動脈，用貼片法進行 PASMC的原代培養。采用細胞分裂相脫離同步化法，使細胞進入同步化生長4。 2.PASMC的缺氧培養：已同步化的PASMC接種于96孔板24 h后，換成含5%小牛血清RPMI-1640 培養液，進行缺氧及常氧對照實驗。缺氧裝置為自制有機玻璃小室，以20 mL/min連續通入5 % CO295N2的混合氣體，測得小室內氧氣濃度維持在23%(CR-2測氧儀監測 )，小室置于

11、37培養箱內。常氧對照組的細胞置于5% CO2孵箱內。3.四唑鹽比色(MTT)試驗：用0.25%胰蛋白酶消化細胞，用含10%小牛血清的RPMI-1640配制 成 5×104細胞/ml的細胞懸液，移入96孔板，細胞數為5×103100 L-1/孔， 將培養板移入CO 2孵箱中，在37、5% CO2及飽和濕度條件下，培養24 h，移去舊培養液，換5%胎牛 血清的RPMI-1640，并加入Sal，在含2%3% O2缺氧小室繼續孵育20 h后，每孔加入MTT 溶液(5 mg/mL) 20 L，繼續孵育4 h，終止培養，小心吸棄孔內上清液，每孔加入DMSO 150L，振蕩10 min

12、，選擇490 nm波長在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收值(OD值)。4.3H-TdR摻入實驗：將消化好的細胞懸液移入96孔板，使細胞數為5×103100 L-1/孔，培養24 h后，換為5%小牛血清的RPMI-1640培養液，同時加入Sal， 在含2%3 CO2缺氧小室繼續培養18 h，然后加入3H-TdR(3.7×104 Bq/mL)，再繼 續孵育6 h后，中止反應，收集細胞于9999型玻璃纖維濾紙上，用液閃計數器測定3H -TdR摻入量。5.流式細胞儀(FCM)測定細胞周期：長成單層的PASMC換含5%小牛血清RPMI-1640培養液，分 常氧(21%)，缺氧(2%3）

13、，缺氧(2%3）+Sal組，培養24 h后，用0.25%胰酶-EDTA 消化離心收集細胞，0.01 mol/L pH 7.4 PBS洗2次，1 000 r/min 離心10 min，上機前加 含RNA 酶的PI染液4 30 min，調細胞濃度至106/mL，用FCM EPICS Profile 型測定細胞周 期。6.c-fos,c-myc原癌基因斑點雜交：制備1×106細胞/mL懸液，每組加入10 mL 懸液，培 養24 h以后，換為含5%小牛血清RPMI-1640培養基，分別作常氧及缺氧培養，24 h后加Sal， 分別 于30 min，1 h中止反應并收集細胞，按文獻5方法提取總R

14、NA，以260 nm波長紫 外光吸光度測定RNA含量，c-fos基因探針長1.6 kb，c-myc基因探針長1.3 kb， 通過缺口 平移法進行放射性標記，每一樣品點兩個斑點，用量分別為5 g,2.5 g RNA，然后按文 獻6方法進行RNA斑點雜交，最后進行放射自顯影。7.統計分析：所有數據均以平均數±標準差(<"Image361 (850 bytes)" src="/med/cano/201003/20100310170359346" 14 17>±s)表示，以組間t檢驗判 斷差異顯著性。細胞周期采用總體率假設檢驗。&

15、#160;    結果 1.Sal對缺氧狀態下PASMC增殖和DNA合成的影響：結果如1所示，結果表明，Sal可抑制缺 氧所致的PASMC增殖和DNA合成。以單純缺氧組為對照，Sal使PASMC的OD值下降23%，3 H-TdR摻入量 下降28%(P0.05)。PASMC的OD值下降45%，3H-TdR摻 入量下降28%(P0.05)。    Fig 1 Effects of salidroside on the proliferation and DNA synthesis o f PASMC under hypoxiaP

16、0.05,vs H group;? P0.01, vs N group(<"Image361 (850 bytes)" src="/med/cano/201003/20100310170359346" 14 17>±s,n=12)N=normoxia; H=hypoxia; H+Sal=hypoxia+salidroside1紅景天甙對缺氧狀態下PASMC增殖和DNA合成的影響2.紅景天甙對缺氧狀態下PASMC細胞周期的影響：流式細胞分析表 明，與常氧對照 組相比，PASMC缺氧培養24 h后，顯著增加進入G2/M期的細胞比例，顯著

17、減少進入G0 G1期的細胞比例(P0.01)，Sal能減少缺氧的PASMC進入G2M期的細胞 比例(P0.05)，增加進入G0G1期的細胞比例(P0.05)，使更多的P ASMC處 于相對靜止期，如2所示。    Fig 2 Effect of salidroside on the cell cycle of PASMC under hyp oxiaA=normoxia; B=hypoxia; C=salidroside+hypoxia2紅景天甙對缺氧狀態下PASMC細胞周期的影響3.紅景天甙對缺氧狀態下PASMC的c-fos,c-myc基因表達的影響：

18、結果如 3所 示。可見缺氧組PASMC的斑點灰度較常氧組高，而在缺氧組PASMC中加入Sal后，于30 min，1 h收集細胞，分別作c-fos,c-myc原癌基因的斑點雜交，則斑點灰度較單純缺氧組低。    Fig 3 Effect of salidroside on the expression of c-fos (1,2,3)、c- myc(4,5,6) oncogene of PASMC under hypoxia1,4=normoxia; 2,5=hypoxia; 3,6=hypoxia+salidroside3紅景天甙對PASMC c-fos

19、、c-myc原癌基因表達的影響討論大量研究證明，肺血管平滑肌在缺氧環境下的增生導致肺血管壁結構重建。影響PASMC增殖 的因素很多，Reusch等7報道機械張力可通過JNK/SAPK和ERK(extracellular sig nal-regul ated kinase)系統的激活促進PASMC的增殖。生長因子如PDGF，EGF等可通過改變 細胞內NaH交換促進PASMC的增殖8。Cornfield等研究發現9 ，急性缺氧可引起PASMC內Ca2增高，而Ca2是細胞增殖活動中重 要的第二信使，PKC的激活依賴于Ca2。各種刺激PASMC增殖的因素通過細胞內信息 傳導的共同通路如Ras/MAPK

20、、Raf-1系統10、cGMP、磷酸酶/磷脂系統的激活將 細胞外信息傳遞到細胞核內，誘導c-myc,c-fos,c-jun等原癌基因快速短暫轉 錄和表達，促進與DNA合成相關蛋白的合成，進而促進PASMC的增殖。本研究表明，紅景天甙可顯著抑制缺氧對PASMC增殖和DNA合成的促進作用，抑制缺氧所致的 G2/M期細胞比例增多，使更多的PASMC處于G0G1期，從而抑制PASMC的增殖， 研究還表明Sal可抑制缺氧所致的c-fos,c-myc mRNA表達增加。本研究為Sal應用于 臨床防治 缺氧性肺動脈高壓提供了理論基礎，但其抑制PASMC的增殖及原癌基因表達的細胞內信號傳 導途徑還有待進一步研

21、究。作者單位：趙賀玲林樹新賈斌張莉莉第四軍醫大學病生教研室(西安710032)張世范蘭州軍區總醫院胸外科     參考文獻 1Davies P, Patton W. Peripheral and central vascular smooth muscle cells from rat lung exhibit different cytoskeletal protein profiles but similar growth factor requirements. J Cell Physiol, 1994, 159(3):399.2Kulik TJ,

22、 Alvarado SP. Effect of stretch on growth and collagen synth esis in cu ltured rat and lamb pulmonary arterial smooth muscle cells. J Cell Physiol, 1993 , 157(3):615.3昝俊平，謝印之，孫興斌，等.紅景天中藥復方提高高原機體勞動能力的效果觀 察.解放軍預防醫學雜志，1994，12(1)：17.4鄂征.細胞同步化法.鄂征主編.組織與細胞培養技術.第3版.北京：人民衛 生出版社，1994. 201.5Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid g uanidinium thiocyanate-phenol-chlororm extraction. Anal Biochem, 1987, 162:156. 6盧圣東.現代分子生物學技術.北京：高等教育出版社，1993，167.7Reusch HP, Chan G, Ives HE, et al. Activation of JNK/SAPK and ERK by m echanical strain in vas