1、ii©Copyright 2004, Applied Biosystems. All rights reserved.For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.Authorized Thermal CyclerThis instrument, Serial No_, is an Authorized Thermal Cycler. Its purchase price includes the up-front fee component of a license under United States P

2、atent Nos. 4,683,195, 4,683,202 and 4,965,188, owned by Roche Molecular Systems, Inc., and under corresponding claims in patents outside the United States, owned by F. Hoffmann-La Roche Ltd, covering the Polymerase Chain Reaction ("PCR") process to practice the PCR process for internal res

3、earch and development using this instrument. The running royalty component of that license may be purchased from Applied Biosystems or obtained by purchasing Authorized Reagents. This instrument is also an Authorized Thermal Cycler for use with applications licenses available from Applied Biosystems

4、. Its use with Authorized Reagents also provides a limited PCR license in accordance with the label rights accompanying such reagents. Purchase of this product does not itself convey to the purchaser a complete license or right to perform the PCR process. Further information on purchasing licenses t

5、o practice the PCR process may be obtained by contacting the Director of Licensing at Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404.DISCLAIMER OF LICENSE: No rights for any application, including any in vitro diagnostic application, are conveyed expressly, by implicatio

6、n or by estoppel under any patent or patent applications claiming homogeneous or real-time detection methods, including patents covering such methods used in conjunction with the PCR process or other amplification processes. The 5' nuclease detection assay and certain other homogeneous or real-t

7、ime amplification and detection methods are covered by United States Patent Nos. 5,210,015, 5,487,972, 5,804,375 and 5,994,056, owned by Roche Molecular Systems, Inc.; by corresponding patents and patent applications outside the United States, owned by F. Hoffmann-La Roche Ltd; and by United States

8、Patent Nos. 5,538,848 and 6,030,787, and corresponding patents and patent applications outside the United States, owned by Applera Corporation. Purchase of this instrument conveys no license or right under the foregoing patents. Use of these and other patented processes in conjunction with the PCR p

9、rocess requires a license. For information on obtaining licenses, contact the Director of Licensing at Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, or The Licensing Department, Roche Molecular Systems, Inc., 1145 Atlantic Avenue, Alameda, California, 94501, USA.Tradem

10、arksApplied Biosystems, MicroAmp, Primer Express, ROX, and VIC are registered trademarks of Applera Corporation or its subsidiaries in the US and/or certain other countries.AB (Design), ABIPRISM, Applera, Assays-by-Design, Assays-on-Demand, Celera Genomics, FAM, iScience, iScience (Design), and Mult

11、iScribe are trademarks of Applera Corporation or its subsidiaries in the US and/or certain other countries.AmpErase, AmpliTaq Gold, and TaqMan are registered trademarks of Roche Molecular Systems, Inc.SYBR Green is a registered trademark of Molecular Probes, Inc.Microsoft and Windows are registered

12、trademarks of Microsoft Corporation.All other trademarks are the sole property of their respective owners.Part Number 4347966 Rev. A3/20047300/7500 實時定量 PCR 儀相對定量實驗入門指南󰀁󰀂t/7300/7500 󰀂t/ PCR 󰀅󰀆󰀇t/󰀊󰀋iiiiv7300/7500 󰀂t/ PCR 󰀅

13、;󰀆󰀇t/󰀊󰀋目錄相對定量實驗工作流程前言iiivii如何使用本指南 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii如何獲取更多信息 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . viii如何獲取服

14、務與支持 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . viii將您的意見和建議發送給我們 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . viii第 1 章簡介和相對定量示例實驗1概述 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

15、 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1關于 7300/7500 PCR 儀 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2關于相對定量分析 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2關于相

16、對定量實驗 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2相對定量示例實驗 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5第 2 章設計相對定量實驗11工作流程 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

17、 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11選擇 PCR 方法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12設定相對定量實驗 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

18、. . . .13選擇化學熒光 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15選擇一步法或兩步法反轉錄-聚合酶鏈反應 (RT-PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16選擇探針和引物 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

19、 . . . . . . . . . . . . . .17第 3 章19. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19準備 RNA 指南 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20將總 RNA 轉化為 cDNA . . .

20、 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21第 4 章從相對定量反應板生成數據23工作流程 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23開始之前 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

21、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24準備 PCR 擴增預混試劑 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .247300/7500 實時定量 PCR 儀相對定量實驗入門指南v第 5 章附錄 Avi準備反應板 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

22、. . . . . . . . . . . . . . . . . . .25創建相對定量 (RQ) 反應板文件 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26指定熱循環條件并開始運行反應板 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30分析和查看相對定量反應板數據 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

23、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32導出相對定量反應板數據 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .34在相對定量研究中分析數據35工作流程 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .35創建相對定量研究文件 .

24、 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36設置反應參數 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .38調整基線和閾值 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

25、. . . . . . . . . . . . . . . . . .40分析和查看相對定量研究結果 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45再次分析相對定量研究 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49忽略研究中的樣本 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

26、 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50導出相對定量研究數據 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52創建探針53參考文獻55索引577300/7500 實時定量 PCR 儀相對定量實驗入門指南前言如何使用本指南本指南的目的假定本指南為使用美國應用生物系統公司 7300/7500 實時定量 PCR 儀（7300/7500 PCR 儀）執行基因表達相

27、對定量實驗分析的主要研究人員及實驗室人員而編寫。本指南假定您已具備以下條件：熟悉 Microsoft® Windows® XP 操作系統。具備處理 DNA 和 RNA 樣本及為 PCR 準備樣本的一般知識和技能。具備有關硬盤驅動器、數據存儲、文件傳輸、重復和粘貼數據的一般常識。如果您希望將 7300/7500 PCR 儀集成到現有的實驗室數據流系統中，則需具備網絡經驗。文字體例粗體 表示用戶動作。例如：鍵入 0，然后對剩余的每個字段按一下 Enter 鍵。斜體 表示新的或重要的內容，也用于表示強調。例如：在開始分析之前，請始終準備好新鮮基質。右箭頭狀尖括號 (>) 用

28、于分開您從下拉菜單或快捷菜單中依次選擇的命令。例如：選擇 File（文件）> Open（打開）> Spot Set（點設置）。在美國應用生物系統公司用戶文檔中，包括以下用戶警示文字。每種警示文字表示需遵守事項或執行動作的不同重要性級別，如下所述：注釋：提供使用產品的有趣或幫助性信息，但并非使用產品不可或缺的事項或操作。重要！提供正確操作儀器、精確使用化學試劑或確保安全使用某化學品所必須遵守的要求或必須執行的操作。表示存在潛在的危險狀況，如果不加以避免，則可能導致輕度或中度人身傷害。也用于提醒避免不安全的操作。表示存在潛在的危險狀況，如果不加以避免，則可能導致死亡或嚴重人身傷害。用戶

29、警示文字7300/7500 實時定量 PCR 儀相對定量實驗入門指南vii前言如何獲取更多信息安全注意事項有關重要的安全注意事項信息，請參閱美國應用生物系統公司 7300/7500 實時定量 PCR 儀安裝和維護入門指南和美國應用生物系統公司 7300/7500 實時定。量 PCR 儀場地準備指南如何獲取更多信息有關使用 7300/7500 系統的更多信息，請參閱：美國應用生物系統公司 7300/7500 實時定量 PCR 儀聯機幫助美國應用生物系統公司 7300/7500 實時定量 PCR 儀等位基因鑒別實驗入門（貨號 4347964）指南美國應用生物系統公司 7300/7500 實時定量

30、PCR 儀陽性/陰性實驗入門指（貨號 4347965）南美國應用生物系統公司 7300/7500 實時定量 PCR 儀絕對定量實驗入門指（貨號 4347963）南美國應用生物系統公司 7300/7500 實時定量 PCR 儀安裝和維護入門指南（貨號 4347967）美國應用生物系統公司 7300/7500 實時定量 PCR 儀場地準備指南（貨號 4347968）序列檢測系統化學指南（貨號 4348358）ABIPRISM® 7700 Sequence Detection System User Bulletin #2: RelativeQuantitation of Gene Exp

31、ression（ABIPRISM® 7700 序列檢測系統用戶布告牌 （貨號 4303859）#2：基因表達相對定量研究）如何獲取服務與支持有關不同地區產品服務和技術支持的最新信息，請登錄網站 并單擊 Support（支持）鏈接查閱。在 Support（支持）頁上，您可以：搜索并查閱常見問題與解答 (FAQ)直接向技術支持人員提交問題進行咨詢訂購美國應用生物系統公司用戶文檔、材料安全數據表 (MSDS)、分析證書及其它相關文檔下載 PDF 文檔獲取有關客戶培訓的信息下載軟件更新和補丁程序此外，在 Support（支持）網頁上還提供全球各地美國應用生物系統公司技術支持和銷售機構的電話和

32、傳真號碼。將您的意見和建議發送給我們美國應用生物系統公司歡迎您對我們的文檔提出您的寶貴意見和建議，以不斷提高我們的用戶文檔質量。請將您的意見或建議發送電子郵件至：techpubsviii7300/7500 實時定量 PCR 儀相對定量實驗入門指南概述注釋7300/7500 實時定量 PCR 儀相對定量實驗入門指南1第 1 章 簡介和相對定量示例實驗關于 7300/7500 PCR 儀關于 7300/7500 PCR 儀說明美國應用生物系統公司 7300/7500 實時定量 PCR 儀（7300/7500 PCR 儀）使用基于化學熒光的 PCR 檢測手段，提供采用實時分析法的核酸序列定量檢測，和

33、采用終點和熔解曲線分析法的核酸序列定性檢測功能。7300/7500 實時定量 PCR 儀允許使用 96 孔格式的反應板或試管執行幾種檢測分析。本指南描述相對定量 (RQ) 實驗分析。有關其它實驗檢測與分析的說明，請參閱序列檢測系統化學指南(SDSChemistry Guide) 和美國應用生物系統公司 7300/7500 實時定量 PCR 儀聯機幫助 (Online Help)。相對定量分析關于相對定量分析定義相對定量分析用來測定一個測試樣本中核酸序列（目標）與校正樣本中同一序列表達的相對變化。 校正樣本可以是一個未經處理的對照或者是在一個時程研究中處于零時的樣本（Livak 和 Schmit

34、tgen，2001）。 例如，相對定量通常用來比較野生型與突變型等位基因的表達水平或不同組織中某個基因的表達水平。相對定量可以對每個樣本中模板的起始水平之間的差異進行精確比較，而無需知道模板的確切拷貝數。 而且，樣本中模板的相對水平無需使用標準曲線就可以確定。實時 PCR 分析相對定量 (RQ) 分析以實時 PCR 方式執行。在實時 PCR 分析過程中，PCR 基因擴增一直在您的監控之中。在 PCR 進行期間進行數據采集，而不是在 PCR 結束時（終點 PCR）才獲取數據。在實時 PCR 中，反應是在目標的擴增最早被監測到時用循環中的時間點來描述的，而不是在 PCR 結束時通過目標的累積數來描

35、述。實時定量 PCR 分析有兩種類型： 絕對定量和相對定量。關于相對定量實驗相對定量 (RQ)實驗工作流程本文檔中“相對定量 (RQ) 實驗”術語是指相對定量實驗分析的整個過程，以從核糖核酸 (RNA) 生成互補脫氧核糖核酸 (cDNA)（反轉錄）為起點，直到分析相對定量研究結束。 有關相對定量實驗工作流程，請參閱第 iii 頁。注釋27300/7500 實時定量 PCR 儀相對定量實驗入門指南關于相對定量實驗使用 7300/7500 PCR 儀執行相對定量研究使用 7300/7500PCR 儀執行相對定量研究相對定量分析的數據收集部分是一個單一反應板文件，稱為 RQ Plate（相對定量反應

36、板）。 運行 PCR 程序期間收集的擴增數據以及樣本設定信息都保存在反應板中。相對定量分析的數據分析部分是一個多重反應板文件，稱為 RQ Study（相對定量研究）。 在一個研究中您可以分析多達十個相對定量反應板。 相對定量研究文件既不控制儀器，也不提供設定或修改反應板的工具。1反應板上的反應7300/7500 PCR 儀SDS 軟件相對定量反應板文件SDS 軟件相對定量研究文件注釋：7300/7500 PCR 儀系統軟件只使用比較法 (CT) 來計算核酸序列的相對定量。定量分析中使用的術語基線閾值術語定義PCR 的最初幾次循環，在此基線上熒光信號幾乎沒有變化。Rn（德爾塔校正后報告熒光強度）

37、的一個值 由 SDS 軟件自動確定或手動設置 用于在實時實驗分析中確定 CT 值。此閾值應設置為高于基線，但應足夠地低，使其控制在擴增曲線的指數增長階段范圍之內。閾值線與擴增曲線的交叉點確定 CT 值。熒光信號強度超過設置的閾值強度時所經歷的循環數。一種熒光，其本身產生一種內部熒光，通過參比這種熒光，在數據分析期間對報告基團的熒光信號進行標準化。標準化對于糾正由于濃度或體積發生改變而引起的熒光波動現象非常必要。此熒光加在 TaqMan 探針的 5 端。此熒光提供的信號作為特異性擴增的指示物。與陽性參比熒光信號強度相比較的報告基團熒光信號強度。在給定的一組 PCR 條件下所生成信號的量值。(Rn

38、 = Rn 基線）閾值循環 (CT)陽性參比熒光報告基團熒光校正后報告熒光強度 (Rn)Delta Rn (Rn)下圖顯示了一個有代表性的擴增圖譜，其中包括上表定義的一些術語。注釋7300/7500 實時定量 PCR 儀相對定量實驗入門指南3第 1 章 簡介和相對定量示例實驗關于相對定量實驗用戶需提供的材料項目ABIPRISM 6100 Nucleic Acid PrepStation（ABIPRISM 6100 核酸提取儀）ABIPRISM Optical Tubes (8 Tubes/Strip) *（ABIPRISM 光學反應管，每條帶 8 支管）ABIPRISM Optical Cap

39、s, 8 caps/strip (Flat)（ABIPRISM 光學反應蓋板，每條帶 8 個蓋板，平板式）High Capacity cDNA Archive Kit (大容量 cDNA 庫試劑盒)TaqMan® Universal PCR Master Mix（TaqMan® 通用 PCR 擴增預混試劑）MicroAmp® Optical 96-Well Reaction Plate（MicroAmp® 光學 96 孔反應板）MicroAmp Optical Tubes *（MicroAmp 光學反應管）Optical Adhesive Cover（孔

40、板高透光度蓋膜）以下任意一種來源的標記引物和探針：Assays-on-Demand Gene ExpressionProducts（Assays-on-Demand 基因表達產品）（預先設計的引物和探針）Assays-by-Design（代客設計引物和探針）服務（預先設計的引物和探針）Primer Express（引物設計）軟件（定制設計引物和探針）帶帽試管，10mL配備 96 孔板轉接器的離心機手套微型離心機來源美國應用生物系統公司（貨號 6100-01）美國應用生物系統公司（貨號 4316567）美國應用生物系統公司（貨號 4323032）美國應用生物系統公司（貨號 4322171）美國應

41、用生物系統公司（貨號 4304437）美國應用生物系統公司（貨號 4306757）美國應用生物系統公司（貨號 N801-0933）美國應用生物系統公司（貨號 4311971）美國應用生物系統公司網址與您當地的美國應用生物系統公司銷售代表聯系貨號 4330710（1 用戶許可證）貨號 4330709（10 用戶許可證）貨號 4330708（50 用戶許可證）美國應用生物系統公司（貨號 4305932）主要實驗室供應商 (MLS)主要實驗室供應商主要實驗室供應商注釋47300/7500 實時定量 PCR 儀相對定量實驗入門指南相對定量示例實驗概述項目微型離心管，無菌型 1.5mL無核酸酶水移液管滴

42、頭，帶過濾塞正置換移液器安全防護眼鏡微型漩渦式混合器 (Vortexer)* 重要：主要實驗室供應商主要實驗室供應商主要實驗室供應商主要實驗室供應商主要實驗室供應商主要實驗室供應商來源1當使用 MicroAmp 光學反應管或 ABIPRISM 光學反應管時，在使用 ABIPRISM 光學反應蓋板覆蓋之后，將其安裝到直接托盤的電極固定架上（不可使用托盤/固位器）。相對定量示例實驗概述為更好地說明怎樣設計、執行及分析相對定量實驗，本節提供一個示例實驗。示例實驗是一個有代表性的典型相對定量實驗，您可將其視為快速入門操作程序來熟悉相對定量實驗的工作流程。相對定量實驗工作流程的詳細步驟將在本指南的后續章

43、節中講述。后續章節中將出現示例實驗描述框，對示例實驗的一些步驟細節加以說明。相對定量示例實驗的目的，是比較一個人的肝臟、腎臟和膀胱組織中 23 種基因的表達水平。實驗設計采用單一 PCR 擴增法 樣本和內對照分別在獨立的反應孔中進行擴增。 使用磷酸甘油醛脫氫酶 (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) 作為內對照。 每個樣本和內對照使用四個重復反應孔進行擴增。 （本示例實驗中，每種組織使用全部 96 孔反應板，因為 23 個基因的四個重復加上內對照的四個重復正好需要全部 96 個反應孔。）從美國應用生物系統公司 Assays-on-De

44、mand 系列產品中選擇預設計和標記的引物/探針組合。反應設定為兩步法反轉錄-聚合酶鏈反應 (RT-PCR)，分別使用 High Capacity cDNA Archive Kit（大容量 cDNA 庫試劑盒）和 TaqMan® Universal PCR Master Mix（TaqMan® 通用 PCR 擴增預混試劑）參與反轉錄和 PCR 擴增。通過運行三個相對定量反應板生成數據，每種組織使用一個反應板。三個反應板都在一個相對定量研究中進行分析，以肝臟樣本作為校正器。說明注釋7300/7500 實時定量 PCR 儀相對定量實驗入門指南5第 1 章 簡介和相對定量示例實驗

45、相對定量示例實驗相對定量示例實驗過程1.設計實驗，參閱第 2 章。a.指定目標、校正器、內對照和重復反應孔。b.訂購使用 TaqMan® 探針的化學熒光試劑。c.訂購適當的 Assays-on-Demand 產品，應能為這 23 種基因提供預設計的引物和探針。2.從肝臟、腎臟和膀胱組織中提取總 RNA，有關指導，請參閱第 3 章。3.使用 High Capacity cDNA Archive Kit（大容量 cDNA 庫試劑盒）將總 RNA 反轉錄成 cDNA。a.按右表所示，準備反轉錄 (RT) 預混試劑。在 High Capacity cDNA Archive KitProtoc

46、ol（大容量 cDNA 庫試劑盒實驗方案）中提供了更詳細的指導。化學品危險。10×反轉錄 (RT) 緩沖液會刺激眼睛、皮膚和呼吸道。請認真閱讀材料安全數據表 (MSDS) 并遵守操作規程。穿戴合適的保護眼罩、衣服和手套。RT Master Mix（反轉錄預混試劑）成分10 Reverse Transcription Buffer（反轉錄緩沖液）25 dNTP（脫氧核苷三磷酸）10隨機引物MultiScribe Reverse Transcriptase（MultiScribe 反轉錄酶），50 U/µL無核酸酶水總計µL / 1 次反應104105µL

47、/ 21 次反應a2108421010521504411050a. 每個反轉錄 (RT) 反應的體積為 100 µL（參閱步驟3b）。對于每種組織的 104 次 PCR 擴增反應（參閱步驟4）的每次反應，如果需要 5 µL cDNA，則每個組織需要 6 次反轉錄 (RT) 反應。應包含額外的體積（足夠用于每種組織執行一次額外反轉錄 (RT) 反應）以彌補移液過程中造成的損失，并需備有額外的 cDNA 用于建庫。b.向反應板的每個反應孔中吸取以下體積的液體，準備 cDNA 庫反應板：50 µL 反轉錄 (RT) 預混試劑30 µL 無核酸酶水20 

48、1;L RNA 樣本確保對于每次 50 µL PCR 擴增反應，從總 RNA 轉化為 cDNA 的質量為 10 至 100 ng，體積為 5 µL。注釋67300/7500 實時定量 PCR 儀相對定量實驗入門指南相對定量示例實驗相對定量示例實驗過程c.使用為兩步法反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR) 方法給出的各項參數值，設計熱循環。注釋：您也可使用一步法反轉錄-聚合酶步驟類型保持保持時間10 分120 分溫度25°C37°C1鏈反應 (RT-PCR)，有關說明，請參閱第 16 頁“選擇一步法或兩步法反轉錄-聚合酶鏈反應 (RT-PCR)”。d.在 2

49、0°C 溫度下貯存 cDNA，直到使用時。4.按右表所示，準備 PCR 擴增預混試劑。有關詳情，請參閱第 4 章。注釋：Assay-by-Design 產品的反應體積在產PCR Master Mix（PCR 擴增預混試劑）反應成分TaqMan Universal PCR MasterMix（TaqMan 通用 PCR 擴增預混試劑）(2)20 Assays-on-Demand Gene Expression Assay Mix（Assays-on-Demand 基因表達實驗分型試劑）acDNA 樣本無核酸酶水總計µL/樣本25.0µL / 5 次反應b125.0終

50、濃度1品的插頁中已說明；使用 Primer Express（引物設計）軟件設計引物和探針時應符合通用分析條件，詳情請參閱第 4 章。化學品危險。TaqMan Universal PCR Master Mix（TaqMan 通用 PCR 擴增預混試劑）對眼睛和皮膚有刺激性。無保護下吞咽或吸入會導致不適感覺。請認真閱讀材料安全數據表 (MSDS) 并遵守操作規程。穿戴合適的保護眼罩、衣服和手套。2.512.515.017.550.025.087.525010-100 ng-a.包含正向引物和反向引物以及標記的探針。b.共準備 24 份擴增預混試劑，23 種基因每種使用一份，內對照使用一份。 需準備

51、 5 個反應體積（4 個重復反應孔加上一次額外反應），以彌補移液過程中造成的損失。1.準備反應板。a.在反應板上作上標簽，確保每個反應板中都包含一個內對照。b.吸取 50 µL 的適當 PCR 擴增預混試劑（含 cDNA），滴入反應板的每一個反應孔中。c.將這些反應板置于冰上，直到您準備好將其裝入 7300/7500 PCR 儀。膀胱樣本內對照 (GAPDH)注釋7300/7500 實時定量 PCR 儀相對定量實驗入門指南7第 1 章 簡介和相對定量示例實驗相對定量示例實驗2.創建相對定量反應板文件，如第 26 頁“創建相對定量 (RQ) 反應板文件”所述。簡言之，a.選擇 File

52、（文件）> New（新建）。b.從 Assay（實驗）下拉列表中，選擇Relative Quantification (ddCt) Plate（相對定量 (ddCt) 反應板），然后單擊Next >（下一步 >）。重要！您不能使用絕對定量 (AQ) 反應板文件執行相對定量 (RQ) 實驗分析，反之亦然。存儲在絕對定量 (AQ) 和相對定量 (RQ) 反應板文件中的信息不可互相交換。c.將探針加到反應板文件中，然后單擊Next >（下一步 >）。d.為每個反應孔指定探針和任務，然后單擊 Finish（完成）。除非您已如右側說明所示指定樣本名，否則，您不能將相對定量反

53、應板添加到相對定量研究中。單擊 OK（確定）。SDS 軟件顯示 Well Inspector（反應孔設定）窗口。3.在 Well Inspector（反應孔設定）窗口（依次選擇 View（視圖）> Well Inspector（反應孔設定）中，輸入樣本名。重要！如果您的實驗不使用反應板上的所有反應孔，此步驟中請不要忽略任何要使用的反應孔。運行結束后，可忽略不使用的反應孔。有關忽略反應孔的更詳細信息，請參閱聯機幫助。右圖顯示了完整的反應板設定。注釋87300/7500 實時定量 PCR 儀相對定量實驗入門指南相對定量示例實驗相對定量示例實驗過程4.開始運行相對定量 (RQ) 程序。a.選擇

54、 Instrument（儀器）選項卡。默認情況下，顯示兩步法反轉錄-聚合酶鏈反應 (RT-PCR) 方法中 PCR 步驟的標準 PCR 條件。b.選擇 File（文件）> Save As（另存1為），輸入相對定量反應板文件的文件名，然后單擊 Save（保存）。c.將反應板裝入儀器中。d.單擊 Start（開始）。運行結束后，屏幕上顯示信息報告運行是否成功或遇到錯誤。5.創建相對定量研究 (RQ Study) 文件，詳情請參閱第 36 頁“創建相對定量研究文件”。簡言之，a.選擇 File（文件）> New（新建）。b.從 Assay（實驗）下拉列表中，選擇 Relative Qua

55、ntification (ddCt) Study（相對定量 (ddCt) 研究），然后單擊 Next >（下一步 >）。重要！RQ Study（相對定量研究）功能對于 7300 PCR 儀是可選項，而對 7500 PCR 儀則是標準配置。c.單擊 Add（添加），將反應板添加到研究中，然后單擊 Open（打開）。注釋：在一個 RQ 研究中，您可添加最多 10 個相對定量反應板。d.單擊 Finish（完成）。注釋7300/7500 實時定量 PCR 儀相對定量實驗入門指南9第 1 章 簡介和相對定量示例實驗相對定量示例實驗6.分析相對定量數據，詳情請參閱第 5 章。a.使用Auto

56、 Ct（自動 Ct）選項設置反應參數()并分析數據。注釋：有關詳情，請參閱第 38 頁“配置分析設置”。如果您知道您所作實驗的最佳基線和閾值設置，可選擇 Manual Ct（手動 Ct）和 Manual Baseline（手動基線）選項。b.如果有必要，手動調整基線和閾值。注釋：參閱第 40 頁“調整基線和閾值”。c.單擊 或選擇Analysis（分析）>Analyze（執行分析）以再次分析數據。在擴增開始前設置基線將閾值設置在曲線的指數增長期范圍內d.在 RQ Results（相對定量結果）窗口中單擊一個選項卡，以查看分析結果。e.如果需要，保存此相對定量研究 (RQStudy) 文件

57、。結論如右圖所示，CCR2 在這個人的肝臟中的表達水平比在其腎臟和膀胱組織中要高。注釋107300/7500 實時定量 PCR 儀相對定量實驗入門指南工作流程注釋7300/7500 實時定量 PCR 儀相對定量實驗入門指南112第 2 章 設計相對定量實驗選擇 PCR 方法選擇 PCR 方法PCR 方法類型PCR 可按以下兩種方法之一執行：單一反應，在反應管或反應孔中存在單一的引物對。 每個反應中只有一個目標序列或內對照可被擴增。多重反應，在反應中存在兩個或更多引物對。 每個引物對可以擴增一個目標序列或一個內對照。選擇標準對于相對定量實驗，兩種方法都可以得出等效的結果。 選擇某種方法時，需考慮以下因素：您用來檢測 PCR 產物的化學試劑類型 單一 PCR 擴增可使用 SYBR® Green 或 TaqMan 化學熒光試劑。 多重 PCR 擴增只能使用 TaqMan 化學熒光試劑。您計劃用來優化和驗證實驗所需花費的