1、ii©Copyright 2004, Applied Biosystems. All rights reserved.For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.Authorized Thermal CyclerThis instrument, Serial No_, is an Authorized Thermal Cycler. Its purchase price includes the up-front fee component of a license under United States P

2、atent Nos. 4,683,195, 4,683,202 and 4,965,188, owned by Roche Molecular Systems, Inc., and under corresponding claims in patents outside the United States, owned by F. Hoffmann-La Roche Ltd, covering the Polymerase Chain Reaction ("PCR") process to practice the PCR process for internal res

3、earch and development using this instrument. The running royalty component of that license may be purchased from Applied Biosystems or obtained by purchasing Authorized Reagents. This instrument is also an Authorized Thermal Cycler for use with applications licenses available from Applied Biosystems

4、. Its use with Authorized Reagents also provides a limited PCR license in accordance with the label rights accompanying such reagents. Purchase of this product does not itself convey to the purchaser a complete license or right to perform the PCR process. Further information on purchasing licenses t

5、o practice the PCR process may be obtained by contacting the Director of Licensing at Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404.DISCLAIMER OF LICENSE: No rights for any application, including any in vitro diagnostic application, are conveyed expressly, by implicatio

6、n or by estoppel under any patent or patent applications claiming homogeneous or real-time detection methods, including patents covering such methods used in conjunction with the PCR process or other amplification processes. The 5' nuclease detection assay and certain other homogeneous or real-t

7、ime amplification and detection methods are covered by United States Patent Nos. 5,210,015, 5,487,972, 5,804,375 and 5,994,056, owned by Roche Molecular Systems, Inc.; by corresponding patents and patent applications outside the United States, owned by F. Hoffmann-La Roche Ltd; and by United States

8、Patent Nos. 5,538,848 and 6,030,787, and corresponding patents and patent applications outside the United States, owned by Applera Corporation. Purchase of this instrument conveys no license or right under the foregoing patents. Use of these and other patented processes in conjunction with the PCR p

9、rocess requires a license. For information on obtaining licenses, contact the Director of Licensing at Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, or The Licensing Department, Roche Molecular Systems, Inc., 1145 Atlantic Avenue, Alameda, California, 94501, USA.Tradem

10、arksApplied Biosystems, MicroAmp, Primer Express, ROX, and VIC are registered trademarks of Applera Corporation or its subsidiaries in the US and/or certain other countries.AB (Design), ABIPRISM, Applera, Assays-by-Design, Assays-on-Demand, Celera Genomics, FAM, iScience, iScience (Design), and Mult

11、iScribe are trademarks of Applera Corporation or its subsidiaries in the US and/or certain other countries.AmpErase, AmpliTaq Gold, and TaqMan are registered trademarks of Roche Molecular Systems, Inc.SYBR Green is a registered trademark of Molecular Probes, Inc.Microsoft and Windows are registered

12、trademarks of Microsoft Corporation.All other trademarks are the sole property of their respective owners.Part Number 4347966 Rev. A3/20047300/7500 實時定量 PCR 儀相對定量實驗入門指南󰀁󰀂t/7300/7500 󰀂t/ PCR 󰀅󰀆󰀇t/󰀊󰀋iiiiv7300/7500 󰀂t/ PCR 󰀅

13、;󰀆󰀇t/󰀊󰀋目錄相對定量實驗工作流程前言iiivii如何使用本指南 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii如何獲取更多信息 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . viii如何獲取服

14、務(wù)與支持 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . viii將您的意見和建議發(fā)送給我們 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . viii第 1 章簡介和相對定量示例實驗1概述 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

15、 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1關(guān)于 7300/7500 PCR 儀 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2關(guān)于相對定量分析 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2關(guān)于相

16、對定量實驗 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2相對定量示例實驗 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5第 2 章設(shè)計相對定量實驗11工作流程 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

17、 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11選擇 PCR 方法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12設(shè)定相對定量實驗 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

18、. . . .13選擇化學(xué)熒光 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15選擇一步法或兩步法反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16選擇探針和引物 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

19、 . . . . . . . . . . . . . .17第 3 章19. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19準備 RNA 指南 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20將總 RNA 轉(zhuǎn)化為 cDNA . . .

20、 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21第 4 章從相對定量反應(yīng)板生成數(shù)據(jù)23工作流程 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23開始之前 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

21、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24準備 PCR 擴增預(yù)混試劑 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .247300/7500 實時定量 PCR 儀相對定量實驗入門指南v第 5 章附錄 Avi準備反應(yīng)板 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

22、. . . . . . . . . . . . . . . . . . .25創(chuàng)建相對定量 (RQ) 反應(yīng)板文件 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26指定熱循環(huán)條件并開始運行反應(yīng)板 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30分析和查看相對定量反應(yīng)板數(shù)據(jù) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

23、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32導(dǎo)出相對定量反應(yīng)板數(shù)據(jù) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .34在相對定量研究中分析數(shù)據(jù)35工作流程 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .35創(chuàng)建相對定量研究文件 .

24、 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36設(shè)置反應(yīng)參數(shù) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .38調(diào)整基線和閾值 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

25、. . . . . . . . . . . . . . . . . .40分析和查看相對定量研究結(jié)果 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45再次分析相對定量研究 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49忽略研究中的樣本 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

26、 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50導(dǎo)出相對定量研究數(shù)據(jù) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52創(chuàng)建探針53參考文獻55索引577300/7500 實時定量 PCR 儀相對定量實驗入門指南前言如何使用本指南本指南的目的假定本指南為使用美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司 7300/7500 實時定量 PCR 儀（7300/7500 PCR 儀）執(zhí)行基因表達相

27、對定量實驗分析的主要研究人員及實驗室人員而編寫。本指南假定您已具備以下條件：熟悉 Microsoft® Windows® XP 操作系統(tǒng)。具備處理 DNA 和 RNA 樣本及為 PCR 準備樣本的一般知識和技能。具備有關(guān)硬盤驅(qū)動器、數(shù)據(jù)存儲、文件傳輸、重復(fù)和粘貼數(shù)據(jù)的一般常識。如果您希望將 7300/7500 PCR 儀集成到現(xiàn)有的實驗室數(shù)據(jù)流系統(tǒng)中，則需具備網(wǎng)絡(luò)經(jīng)驗。文字體例粗體 表示用戶動作。例如：鍵入 0，然后對剩余的每個字段按一下 Enter 鍵。斜體 表示新的或重要的內(nèi)容，也用于表示強調(diào)。例如：在開始分析之前，請始終準備好新鮮基質(zhì)。右箭頭狀尖括號 (>) 用

28、于分開您從下拉菜單或快捷菜單中依次選擇的命令。例如：選擇 File（文件）> Open（打開）> Spot Set（點設(shè)置）。在美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司用戶文檔中，包括以下用戶警示文字。每種警示文字表示需遵守事項或執(zhí)行動作的不同重要性級別，如下所述：注釋：提供使用產(chǎn)品的有趣或幫助性信息，但并非使用產(chǎn)品不可或缺的事項或操作。重要！提供正確操作儀器、精確使用化學(xué)試劑或確保安全使用某化學(xué)品所必須遵守的要求或必須執(zhí)行的操作。表示存在潛在的危險狀況，如果不加以避免，則可能導(dǎo)致輕度或中度人身傷害。也用于提醒避免不安全的操作。表示存在潛在的危險狀況，如果不加以避免，則可能導(dǎo)致死亡或嚴重人身傷害。用戶

29、警示文字7300/7500 實時定量 PCR 儀相對定量實驗入門指南vii前言如何獲取更多信息安全注意事項有關(guān)重要的安全注意事項信息，請參閱美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司 7300/7500 實時定量 PCR 儀安裝和維護入門指南和美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司 7300/7500 實時定。量 PCR 儀場地準備指南如何獲取更多信息有關(guān)使用 7300/7500 系統(tǒng)的更多信息，請參閱：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司 7300/7500 實時定量 PCR 儀聯(lián)機幫助美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司 7300/7500 實時定量 PCR 儀等位基因鑒別實驗入門（貨號 4347964）指南美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司 7300/7500 實時定量

30、PCR 儀陽性/陰性實驗入門指（貨號 4347965）南美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司 7300/7500 實時定量 PCR 儀絕對定量實驗入門指（貨號 4347963）南美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司 7300/7500 實時定量 PCR 儀安裝和維護入門指南（貨號 4347967）美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司 7300/7500 實時定量 PCR 儀場地準備指南（貨號 4347968）序列檢測系統(tǒng)化學(xué)指南（貨號 4348358）ABIPRISM® 7700 Sequence Detection System User Bulletin #2: RelativeQuantitation of Gene Exp

31、ression（ABIPRISM® 7700 序列檢測系統(tǒng)用戶布告牌 （貨號 4303859）#2：基因表達相對定量研究）如何獲取服務(wù)與支持有關(guān)不同地區(qū)產(chǎn)品服務(wù)和技術(shù)支持的最新信息，請登錄網(wǎng)站 并單擊 Support（支持）鏈接查閱。在 Support（支持）頁上，您可以：搜索并查閱常見問題與解答 (FAQ)直接向技術(shù)支持人員提交問題進行咨詢訂購美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司用戶文檔、材料安全數(shù)據(jù)表 (MSDS)、分析證書及其它相關(guān)文檔下載 PDF 文檔獲取有關(guān)客戶培訓(xùn)的信息下載軟件更新和補丁程序此外，在 Support（支持）網(wǎng)頁上還提供全球各地美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司技術(shù)支持和銷售機構(gòu)的電話和

32、傳真號碼。將您的意見和建議發(fā)送給我們美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司歡迎您對我們的文檔提出您的寶貴意見和建議，以不斷提高我們的用戶文檔質(zhì)量。請將您的意見或建議發(fā)送電子郵件至：techpubsviii7300/7500 實時定量 PCR 儀相對定量實驗入門指南概述注釋7300/7500 實時定量 PCR 儀相對定量實驗入門指南1第 1 章 簡介和相對定量示例實驗關(guān)于 7300/7500 PCR 儀關(guān)于 7300/7500 PCR 儀說明美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司 7300/7500 實時定量 PCR 儀（7300/7500 PCR 儀）使用基于化學(xué)熒光的 PCR 檢測手段，提供采用實時分析法的核酸序列定量檢測，和

33、采用終點和熔解曲線分析法的核酸序列定性檢測功能。7300/7500 實時定量 PCR 儀允許使用 96 孔格式的反應(yīng)板或試管執(zhí)行幾種檢測分析。本指南描述相對定量 (RQ) 實驗分析。有關(guān)其它實驗檢測與分析的說明，請參閱序列檢測系統(tǒng)化學(xué)指南(SDSChemistry Guide) 和美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司 7300/7500 實時定量 PCR 儀聯(lián)機幫助 (Online Help)。相對定量分析關(guān)于相對定量分析定義相對定量分析用來測定一個測試樣本中核酸序列（目標）與校正樣本中同一序列表達的相對變化。 校正樣本可以是一個未經(jīng)處理的對照或者是在一個時程研究中處于零時的樣本（Livak 和 Schmit

34、tgen，2001）。 例如，相對定量通常用來比較野生型與突變型等位基因的表達水平或不同組織中某個基因的表達水平。相對定量可以對每個樣本中模板的起始水平之間的差異進行精確比較，而無需知道模板的確切拷貝數(shù)。 而且，樣本中模板的相對水平無需使用標準曲線就可以確定。實時 PCR 分析相對定量 (RQ) 分析以實時 PCR 方式執(zhí)行。在實時 PCR 分析過程中，PCR 基因擴增一直在您的監(jiān)控之中。在 PCR 進行期間進行數(shù)據(jù)采集，而不是在 PCR 結(jié)束時（終點 PCR）才獲取數(shù)據(jù)。在實時 PCR 中，反應(yīng)是在目標的擴增最早被監(jiān)測到時用循環(huán)中的時間點來描述的，而不是在 PCR 結(jié)束時通過目標的累積數(shù)來描

35、述。實時定量 PCR 分析有兩種類型： 絕對定量和相對定量。關(guān)于相對定量實驗相對定量 (RQ)實驗工作流程本文檔中“相對定量 (RQ) 實驗”術(shù)語是指相對定量實驗分析的整個過程，以從核糖核酸 (RNA) 生成互補脫氧核糖核酸 (cDNA)（反轉(zhuǎn)錄）為起點，直到分析相對定量研究結(jié)束。 有關(guān)相對定量實驗工作流程，請參閱第 iii 頁。注釋27300/7500 實時定量 PCR 儀相對定量實驗入門指南關(guān)于相對定量實驗使用 7300/7500 PCR 儀執(zhí)行相對定量研究使用 7300/7500PCR 儀執(zhí)行相對定量研究相對定量分析的數(shù)據(jù)收集部分是一個單一反應(yīng)板文件，稱為 RQ Plate（相對定量反應(yīng)

36、板）。 運行 PCR 程序期間收集的擴增數(shù)據(jù)以及樣本設(shè)定信息都保存在反應(yīng)板中。相對定量分析的數(shù)據(jù)分析部分是一個多重反應(yīng)板文件，稱為 RQ Study（相對定量研究）。 在一個研究中您可以分析多達十個相對定量反應(yīng)板。 相對定量研究文件既不控制儀器，也不提供設(shè)定或修改反應(yīng)板的工具。1反應(yīng)板上的反應(yīng)7300/7500 PCR 儀SDS 軟件相對定量反應(yīng)板文件SDS 軟件相對定量研究文件注釋：7300/7500 PCR 儀系統(tǒng)軟件只使用比較法 (CT) 來計算核酸序列的相對定量。定量分析中使用的術(shù)語基線閾值術(shù)語定義PCR 的最初幾次循環(huán)，在此基線上熒光信號幾乎沒有變化。Rn（德爾塔校正后報告熒光強度）

37、的一個值 由 SDS 軟件自動確定或手動設(shè)置 用于在實時實驗分析中確定 CT 值。此閾值應(yīng)設(shè)置為高于基線，但應(yīng)足夠地低，使其控制在擴增曲線的指數(shù)增長階段范圍之內(nèi)。閾值線與擴增曲線的交叉點確定 CT 值。熒光信號強度超過設(shè)置的閾值強度時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。一種熒光，其本身產(chǎn)生一種內(nèi)部熒光，通過參比這種熒光，在數(shù)據(jù)分析期間對報告基團的熒光信號進行標準化。標準化對于糾正由于濃度或體積發(fā)生改變而引起的熒光波動現(xiàn)象非常必要。此熒光加在 TaqMan 探針的 5 端。此熒光提供的信號作為特異性擴增的指示物。與陽性參比熒光信號強度相比較的報告基團熒光信號強度。在給定的一組 PCR 條件下所生成信號的量值。(Rn

38、 = Rn 基線）閾值循環(huán) (CT)陽性參比熒光報告基團熒光校正后報告熒光強度 (Rn)Delta Rn (Rn)下圖顯示了一個有代表性的擴增圖譜，其中包括上表定義的一些術(shù)語。注釋7300/7500 實時定量 PCR 儀相對定量實驗入門指南3第 1 章 簡介和相對定量示例實驗關(guān)于相對定量實驗用戶需提供的材料項目ABIPRISM 6100 Nucleic Acid PrepStation（ABIPRISM 6100 核酸提取儀）ABIPRISM Optical Tubes (8 Tubes/Strip) *（ABIPRISM 光學(xué)反應(yīng)管，每條帶 8 支管）ABIPRISM Optical Cap

39、s, 8 caps/strip (Flat)（ABIPRISM 光學(xué)反應(yīng)蓋板，每條帶 8 個蓋板，平板式）High Capacity cDNA Archive Kit (大容量 cDNA 庫試劑盒)TaqMan® Universal PCR Master Mix（TaqMan® 通用 PCR 擴增預(yù)混試劑）MicroAmp® Optical 96-Well Reaction Plate（MicroAmp® 光學(xué) 96 孔反應(yīng)板）MicroAmp Optical Tubes *（MicroAmp 光學(xué)反應(yīng)管）Optical Adhesive Cover（孔

40、板高透光度蓋膜）以下任意一種來源的標記引物和探針：Assays-on-Demand Gene ExpressionProducts（Assays-on-Demand 基因表達產(chǎn)品）（預(yù)先設(shè)計的引物和探針）Assays-by-Design（代客設(shè)計引物和探針）服務(wù)（預(yù)先設(shè)計的引物和探針）Primer Express（引物設(shè)計）軟件（定制設(shè)計引物和探針）帶帽試管，10mL配備 96 孔板轉(zhuǎn)接器的離心機手套微型離心機來源美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（貨號 6100-01）美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（貨號 4316567）美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（貨號 4323032）美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（貨號 4322171）美國應(yīng)

41、用生物系統(tǒng)公司（貨號 4304437）美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（貨號 4306757）美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（貨號 N801-0933）美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（貨號 4311971）美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司網(wǎng)址與您當?shù)氐拿绹鴳?yīng)用生物系統(tǒng)公司銷售代表聯(lián)系貨號 4330710（1 用戶許可證）貨號 4330709（10 用戶許可證）貨號 4330708（50 用戶許可證）美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（貨號 4305932）主要實驗室供應(yīng)商 (MLS)主要實驗室供應(yīng)商主要實驗室供應(yīng)商注釋47300/7500 實時定量 PCR 儀相對定量實驗入門指南相對定量示例實驗概述項目微型離心管，無菌型 1.5mL無核酸酶水移液管滴

42、頭，帶過濾塞正置換移液器安全防護眼鏡微型漩渦式混合器 (Vortexer)* 重要：主要實驗室供應(yīng)商主要實驗室供應(yīng)商主要實驗室供應(yīng)商主要實驗室供應(yīng)商主要實驗室供應(yīng)商主要實驗室供應(yīng)商來源1當使用 MicroAmp 光學(xué)反應(yīng)管或 ABIPRISM 光學(xué)反應(yīng)管時，在使用 ABIPRISM 光學(xué)反應(yīng)蓋板覆蓋之后，將其安裝到直接托盤的電極固定架上（不可使用托盤/固位器）。相對定量示例實驗概述為更好地說明怎樣設(shè)計、執(zhí)行及分析相對定量實驗，本節(jié)提供一個示例實驗。示例實驗是一個有代表性的典型相對定量實驗，您可將其視為快速入門操作程序來熟悉相對定量實驗的工作流程。相對定量實驗工作流程的詳細步驟將在本指南的后續(xù)章

43、節(jié)中講述。后續(xù)章節(jié)中將出現(xiàn)示例實驗描述框，對示例實驗的一些步驟細節(jié)加以說明。相對定量示例實驗的目的，是比較一個人的肝臟、腎臟和膀胱組織中 23 種基因的表達水平。實驗設(shè)計采用單一 PCR 擴增法 樣本和內(nèi)對照分別在獨立的反應(yīng)孔中進行擴增。 使用磷酸甘油醛脫氫酶 (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) 作為內(nèi)對照。 每個樣本和內(nèi)對照使用四個重復(fù)反應(yīng)孔進行擴增。 （本示例實驗中，每種組織使用全部 96 孔反應(yīng)板，因為 23 個基因的四個重復(fù)加上內(nèi)對照的四個重復(fù)正好需要全部 96 個反應(yīng)孔。）從美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司 Assays-on-De

44、mand 系列產(chǎn)品中選擇預(yù)設(shè)計和標記的引物/探針組合。反應(yīng)設(shè)定為兩步法反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR)，分別使用 High Capacity cDNA Archive Kit（大容量 cDNA 庫試劑盒）和 TaqMan® Universal PCR Master Mix（TaqMan® 通用 PCR 擴增預(yù)混試劑）參與反轉(zhuǎn)錄和 PCR 擴增。通過運行三個相對定量反應(yīng)板生成數(shù)據(jù)，每種組織使用一個反應(yīng)板。三個反應(yīng)板都在一個相對定量研究中進行分析，以肝臟樣本作為校正器。說明注釋7300/7500 實時定量 PCR 儀相對定量實驗入門指南5第 1 章 簡介和相對定量示例實驗

45、相對定量示例實驗相對定量示例實驗過程1.設(shè)計實驗，參閱第 2 章。a.指定目標、校正器、內(nèi)對照和重復(fù)反應(yīng)孔。b.訂購使用 TaqMan® 探針的化學(xué)熒光試劑。c.訂購適當?shù)?Assays-on-Demand 產(chǎn)品，應(yīng)能為這 23 種基因提供預(yù)設(shè)計的引物和探針。2.從肝臟、腎臟和膀胱組織中提取總 RNA，有關(guān)指導(dǎo)，請參閱第 3 章。3.使用 High Capacity cDNA Archive Kit（大容量 cDNA 庫試劑盒）將總 RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。a.按右表所示，準備反轉(zhuǎn)錄 (RT) 預(yù)混試劑。在 High Capacity cDNA Archive KitProtoc

46、ol（大容量 cDNA 庫試劑盒實驗方案）中提供了更詳細的指導(dǎo)?；瘜W(xué)品危險。10×反轉(zhuǎn)錄 (RT) 緩沖液會刺激眼睛、皮膚和呼吸道。請認真閱讀材料安全數(shù)據(jù)表 (MSDS) 并遵守操作規(guī)程。穿戴合適的保護眼罩、衣服和手套。RT Master Mix（反轉(zhuǎn)錄預(yù)混試劑）成分10 Reverse Transcription Buffer（反轉(zhuǎn)錄緩沖液）25 dNTP（脫氧核苷三磷酸）10隨機引物MultiScribe Reverse Transcriptase（MultiScribe 反轉(zhuǎn)錄酶），50 U/µL無核酸酶水總計µL / 1 次反應(yīng)104105µL

47、/ 21 次反應(yīng)a2108421010521504411050a. 每個反轉(zhuǎn)錄 (RT) 反應(yīng)的體積為 100 µL（參閱步驟3b）。對于每種組織的 104 次 PCR 擴增反應(yīng)（參閱步驟4）的每次反應(yīng)，如果需要 5 µL cDNA，則每個組織需要 6 次反轉(zhuǎn)錄 (RT) 反應(yīng)。應(yīng)包含額外的體積（足夠用于每種組織執(zhí)行一次額外反轉(zhuǎn)錄 (RT) 反應(yīng)）以彌補移液過程中造成的損失，并需備有額外的 cDNA 用于建庫。b.向反應(yīng)板的每個反應(yīng)孔中吸取以下體積的液體，準備 cDNA 庫反應(yīng)板：50 µL 反轉(zhuǎn)錄 (RT) 預(yù)混試劑30 µL 無核酸酶水20 

48、1;L RNA 樣本確保對于每次 50 µL PCR 擴增反應(yīng)，從總 RNA 轉(zhuǎn)化為 cDNA 的質(zhì)量為 10 至 100 ng，體積為 5 µL。注釋67300/7500 實時定量 PCR 儀相對定量實驗入門指南相對定量示例實驗相對定量示例實驗過程c.使用為兩步法反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 方法給出的各項參數(shù)值，設(shè)計熱循環(huán)。注釋：您也可使用一步法反轉(zhuǎn)錄-聚合酶步驟類型保持保持時間10 分120 分溫度25°C37°C1鏈反應(yīng) (RT-PCR)，有關(guān)說明，請參閱第 16 頁“選擇一步法或兩步法反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR)”。d.在 2

49、0°C 溫度下貯存 cDNA，直到使用時。4.按右表所示，準備 PCR 擴增預(yù)混試劑。有關(guān)詳情，請參閱第 4 章。注釋：Assay-by-Design 產(chǎn)品的反應(yīng)體積在產(chǎn)PCR Master Mix（PCR 擴增預(yù)混試劑）反應(yīng)成分TaqMan Universal PCR MasterMix（TaqMan 通用 PCR 擴增預(yù)混試劑）(2)20 Assays-on-Demand Gene Expression Assay Mix（Assays-on-Demand 基因表達實驗分型試劑）acDNA 樣本無核酸酶水總計µL/樣本25.0µL / 5 次反應(yīng)b125.0終

50、濃度1品的插頁中已說明；使用 Primer Express（引物設(shè)計）軟件設(shè)計引物和探針時應(yīng)符合通用分析條件，詳情請參閱第 4 章?；瘜W(xué)品危險。TaqMan Universal PCR Master Mix（TaqMan 通用 PCR 擴增預(yù)混試劑）對眼睛和皮膚有刺激性。無保護下吞咽或吸入會導(dǎo)致不適感覺。請認真閱讀材料安全數(shù)據(jù)表 (MSDS) 并遵守操作規(guī)程。穿戴合適的保護眼罩、衣服和手套。2.512.515.017.550.025.087.525010-100 ng-a.包含正向引物和反向引物以及標記的探針。b.共準備 24 份擴增預(yù)混試劑，23 種基因每種使用一份，內(nèi)對照使用一份。 需準備

51、 5 個反應(yīng)體積（4 個重復(fù)反應(yīng)孔加上一次額外反應(yīng)），以彌補移液過程中造成的損失。1.準備反應(yīng)板。a.在反應(yīng)板上作上標簽，確保每個反應(yīng)板中都包含一個內(nèi)對照。b.吸取 50 µL 的適當 PCR 擴增預(yù)混試劑（含 cDNA），滴入反應(yīng)板的每一個反應(yīng)孔中。c.將這些反應(yīng)板置于冰上，直到您準備好將其裝入 7300/7500 PCR 儀。膀胱樣本內(nèi)對照 (GAPDH)注釋7300/7500 實時定量 PCR 儀相對定量實驗入門指南7第 1 章 簡介和相對定量示例實驗相對定量示例實驗2.創(chuàng)建相對定量反應(yīng)板文件，如第 26 頁“創(chuàng)建相對定量 (RQ) 反應(yīng)板文件”所述。簡言之，a.選擇 File

52、（文件）> New（新建）。b.從 Assay（實驗）下拉列表中，選擇Relative Quantification (ddCt) Plate（相對定量 (ddCt) 反應(yīng)板），然后單擊Next >（下一步 >）。重要！您不能使用絕對定量 (AQ) 反應(yīng)板文件執(zhí)行相對定量 (RQ) 實驗分析，反之亦然。存儲在絕對定量 (AQ) 和相對定量 (RQ) 反應(yīng)板文件中的信息不可互相交換。c.將探針加到反應(yīng)板文件中，然后單擊Next >（下一步 >）。d.為每個反應(yīng)孔指定探針和任務(wù)，然后單擊 Finish（完成）。除非您已如右側(cè)說明所示指定樣本名，否則，您不能將相對定量反

53、應(yīng)板添加到相對定量研究中。單擊 OK（確定）。SDS 軟件顯示 Well Inspector（反應(yīng)孔設(shè)定）窗口。3.在 Well Inspector（反應(yīng)孔設(shè)定）窗口（依次選擇 View（視圖）> Well Inspector（反應(yīng)孔設(shè)定）中，輸入樣本名。重要！如果您的實驗不使用反應(yīng)板上的所有反應(yīng)孔，此步驟中請不要忽略任何要使用的反應(yīng)孔。運行結(jié)束后，可忽略不使用的反應(yīng)孔。有關(guān)忽略反應(yīng)孔的更詳細信息，請參閱聯(lián)機幫助。右圖顯示了完整的反應(yīng)板設(shè)定。注釋87300/7500 實時定量 PCR 儀相對定量實驗入門指南相對定量示例實驗相對定量示例實驗過程4.開始運行相對定量 (RQ) 程序。a.選擇

54、 Instrument（儀器）選項卡。默認情況下，顯示兩步法反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR) 方法中 PCR 步驟的標準 PCR 條件。b.選擇 File（文件）> Save As（另存1為），輸入相對定量反應(yīng)板文件的文件名，然后單擊 Save（保存）。c.將反應(yīng)板裝入儀器中。d.單擊 Start（開始）。運行結(jié)束后，屏幕上顯示信息報告運行是否成功或遇到錯誤。5.創(chuàng)建相對定量研究 (RQ Study) 文件，詳情請參閱第 36 頁“創(chuàng)建相對定量研究文件”。簡言之，a.選擇 File（文件）> New（新建）。b.從 Assay（實驗）下拉列表中，選擇 Relative Qua

55、ntification (ddCt) Study（相對定量 (ddCt) 研究），然后單擊 Next >（下一步 >）。重要！RQ Study（相對定量研究）功能對于 7300 PCR 儀是可選項，而對 7500 PCR 儀則是標準配置。c.單擊 Add（添加），將反應(yīng)板添加到研究中，然后單擊 Open（打開）。注釋：在一個 RQ 研究中，您可添加最多 10 個相對定量反應(yīng)板。d.單擊 Finish（完成）。注釋7300/7500 實時定量 PCR 儀相對定量實驗入門指南9第 1 章 簡介和相對定量示例實驗相對定量示例實驗6.分析相對定量數(shù)據(jù)，詳情請參閱第 5 章。a.使用Auto

56、 Ct（自動 Ct）選項設(shè)置反應(yīng)參數(shù)()并分析數(shù)據(jù)。注釋：有關(guān)詳情，請參閱第 38 頁“配置分析設(shè)置”。如果您知道您所作實驗的最佳基線和閾值設(shè)置，可選擇 Manual Ct（手動 Ct）和 Manual Baseline（手動基線）選項。b.如果有必要，手動調(diào)整基線和閾值。注釋：參閱第 40 頁“調(diào)整基線和閾值”。c.單擊 或選擇Analysis（分析）>Analyze（執(zhí)行分析）以再次分析數(shù)據(jù)。在擴增開始前設(shè)置基線將閾值設(shè)置在曲線的指數(shù)增長期范圍內(nèi)d.在 RQ Results（相對定量結(jié)果）窗口中單擊一個選項卡，以查看分析結(jié)果。e.如果需要，保存此相對定量研究 (RQStudy) 文件

57、。結(jié)論如右圖所示，CCR2 在這個人的肝臟中的表達水平比在其腎臟和膀胱組織中要高。注釋107300/7500 實時定量 PCR 儀相對定量實驗入門指南工作流程注釋7300/7500 實時定量 PCR 儀相對定量實驗入門指南112第 2 章 設(shè)計相對定量實驗選擇 PCR 方法選擇 PCR 方法PCR 方法類型PCR 可按以下兩種方法之一執(zhí)行：單一反應(yīng)，在反應(yīng)管或反應(yīng)孔中存在單一的引物對。 每個反應(yīng)中只有一個目標序列或內(nèi)對照可被擴增。多重反應(yīng)，在反應(yīng)中存在兩個或更多引物對。 每個引物對可以擴增一個目標序列或一個內(nèi)對照。選擇標準對于相對定量實驗，兩種方法都可以得出等效的結(jié)果。 選擇某種方法時，需考慮以下因素：您用來檢測 PCR 產(chǎn)物的化學(xué)試劑類型 單一 PCR 擴增可使用 SYBR® Green 或 TaqMan 化學(xué)熒光試劑。 多重 PCR 擴增只能使用 TaqMan 化學(xué)熒光試劑。您計劃用來優(yōu)化和驗證實驗所需花費的