1、    常染色體顯性遺傳的薄基底膜腎病與 COL4A3COL4A4基因連鎖        摘要目的：運用2號染色體上與COL4A3COL4A4基因緊密連鎖的微衛星標志PAX3及D2S401，對9個薄基底膜腎病家系進行基因連鎖分析，并對薄基底膜腎病患者COL4A4基因上文獻報道的一個點突變進行研究。方法：PCR擴增9例薄基底膜腎病患者及其家系成員2號染色體上的微衛星標志PAX3及D2S401，10聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染分析結果，運用PPAP軟件計算Lodscore值

2、；PCR擴增9例薄基底膜腎病患者COL4A4基因上文獻報道的GA（GlyGlu）的點突變，Alul酶切后分析結果。結果：3個家系的薄基底膜腎病與2號染色體上的COL4A3COL4A4基因連鎖，座位間的Lodscore值為3.10，0.00，未在9例薄基底膜腎病患者COL4A4基因上發現文獻報道的Alul酶切位點。結論：常染色體顯現遺傳的薄基底膜腎病與位于2號染色體上的COL4A3COL4A4基因連鎖，未在9例薄基底膜腎病患者COL4A4基因上發現文獻報道的GA（GlyGlu）的點突變。關鍵詞薄基底膜腎病連鎖分析遺傳基因AUTOSOMAL DOMINANT THIN BASEMENT MEMBR

3、ANE NEPHROPATHYWAS LINKED WITH COL4A3COL4A4 GENEZhang Chengying，Zhu Shile，Zhang YoukangDepartment of Nephrology，The First Teaching Hospital，Beijing Medical University，Beijing，100034OBJECTIVE We performed genetic analysis on 9 pedigrees of Thin Basement Membrane Nephropathy by using microsatellite ma

4、rkers PAX3 and D2S401 closely linked with COL4A3COL4A4 gene located on chromosome 2，and by studying one point mutation in COL4A4 gene of 9 TBMN by digesting PCR products with restriction enzymeMETHODOLOGY Genomic DNA was extractedHighly polymorphic microsatellite markers （PAX3 and D2S401）closely lin

5、ked with COL4A3COL4A4 gene located on chromosome 2 were amplified using PCRNine TBMN families were analyzedOne DNA fragment with possible point mutation was PCR amplified and was digested with restrictive enzyme AlulRESULTS Three of the 9 TBMN families were linked with COL4A3COL4A4 gene located on c

6、hromosome 2（lod score3.1，0.00）No Alul locus was found in COL4A3COL4A4 gene in 9 TBMN，and no GA（GlyGlu）point mutation was detectedCONCLUSION Autosomal dominant TBMN was linked with COL4A3COL4A4 gene on chromosome 2Key words thin basement membrane nephropathy linkage analysis genetic gene薄基底膜腎病（Thinba

7、sementmembranenephropathy，TBMN）是以持續性鏡下血尿為主要表現的一種遺傳性腎病，腎活檢超微結構檢查腎小球基底膜(GBM)彌漫性變薄為該病唯一重要的病理學特征。研究表明，TBMN約占腎活檢病例的3.7，單純性血尿腎活檢病例的11.51，提示該病在臨床上并不少見，而關于TBMN的發病機制研究甚少。1996年Lemmink2首次用基因連鎖分析的方法證實TBMN與位于2q3537的COL4A3COL4A4基因連鎖，并在COL4A4基因上發現一由GA（GlyGlu）的點突變，而Yamazaki3的研究表明TBMN并不與COL4A3基因連鎖。國內尚無關于TBMN發病機制的報道。

8、本研究試通過基因連鎖分析的方法對中國的TBMN進行研究，確定TBMN的相關基因，并對TBMN的發病機制進行初步探討。1對象和方法11TBMN診斷標準臨床，實驗室檢查（包括可疑患者的電測聽和眼科檢查）和病理學改變排除繼發性腎小球疾病，泌尿外科疾病和Alport綜合征屬原發性腎小球疾病者。GBM變薄范圍80；GBM的平均厚度280nm（對照組GBM厚度的均值減去3倍標準差為限1。12研究對象9例TBMN先證者為經腎活檢超微結構檢查及電鏡照片GBM厚度測定證實為TBMN患者，所有家系成員均經過兩次以上的尿沉渣紅細胞位相檢查及血壓、血肌酐測定，凡尿沉渣紅細胞計數3個HP，診斷為血尿，家系成員中的血尿患

9、者均認為系TBMN患者，絕大多數家系成員血壓、血肌酐值正常（附表）。13家系成員外周靜脈血白細胞DNA提取采用1988年Miller等4提出的鹽析法。14基因連鎖分析141PCR擴增2號染色體的微衛星標志PAX3、D2S401PAX3引物序列5：5CCC AGA TGC CTT CTTA3，5CAG GGA GAT GGC AGT T3。PCR反應體系：25l反應體系含基因組DNA200ng，dNTP200molL，引物各10pmol，MgCl20.75mmolL，TaqDNA聚合酶1單位。PCR反應條件：94預變性5min；94 1min，491min，721min，循環30次；72 延伸1

10、0min。D2S401引物序列6：5CAG AAG TTG CAG AAC CAT3，5GGG AGA TTT GGA GAAACA3。PCR反應條件：MgCl21.0mmolL，退火溫度50，余同PAX3。14210聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）附表9例TBMN患者的家族史、臨床表現、眼耳改變及腎臟病理改變例號性別年齡家族史血尿蛋白尿腎功能眼、耳檢查腎臟病理改變光鏡免疫熒光電鏡1女23有鏡下血尿陰性正常無異常輕度系膜增生IgMGBM彌漫性變薄（203.5±33.4nm）2女53有肉眼血尿陰性正常無異常輕度系膜增生IgM、IgA±GBM彌漫性變薄（228.9±48

11、.5nm）3女38有鏡下血尿陰性正常無異常輕度系膜增生IgA±、FRAGBM彌漫性變薄（191.5±26.5nm）4女36有鏡下血尿陰性正常無異常腎小球輕微病變陰性GBM彌漫性變薄（265.6±56.4nm）5女27有鏡下血尿陰性正常無異常輕度系膜增生IgM±、C3±GBM彌漫性變薄（231.7±29.1nm）6女15有鏡下血尿陰性正常無異常輕度系膜增生IgMGBM彌漫性變薄（229.5±41.4nm）7女19有鏡下血尿陰性正常無異常腎小球輕微病變陰性GBM彌漫性變薄（212.4±70.1nm）8女53有鏡下血尿陰

12、性正常無異常輕度系膜增生陰性GBM彌漫性變薄（179.1±23.1nm）9女30有鏡下血尿陰性正常無異常輕度系膜增生IgM±、IgA±GBM彌漫性變薄（253.8±24.0nm）143銀染并分析結果144運用哈爾濱醫科大學數學教研室研制的PPAP軟件計算Lod score值715基因突變研究151PCR擴增2號染色體COL4A4基因上文獻報道的一個點突變引物序列2：5AAG GCC TCC CCG GAC TCC CA3，5ACC TGG AGG ACC AGG TAGC3。PCR反應條件：MgCl2 0.75 mmolL，退火溫度60。152Alul酶

13、切PCR產物15l反應體系含10×buffer1.5l，BSA（10gl）0.15l，Alul（10 Ul）0.25l，ddH2O 9.1l，PCR產物4l，混勻后37水浴過夜，次日加入3l loading buffer終止反應。15310聚丙烯酰胺凝膠電泳154銀染并分析結果 2結果21基因連鎖分析3個家系的TBMN位于2號染色體上的COL4A3COL4A4基因連鎖，座位間的Lodscore為3.1，0.00（1，2）。家系1，先證者4。因鏡下血尿經腎活檢證實為TBMN，追蹤其家系，發現其母親2及四個姐妹1、2、3及6均有鏡下血尿，尿沉渣紅細胞位相檢查為多型紅細胞。找出此家系中與T

14、BMN連鎖的單體型為PAX3PCR產物電泳的第二片段及D2S401PCR產物電泳的第四片段。遺傳了單體型（PAX32D2S4014）的2、1、2、3、4和6均為患者。先證者4之子未從母親遺傳到單體型（PAX32D2S4014），故未患病。2從生物學意義上不是1之女，但由于從母親遺傳到單體型（PAX32D2S4014），故也發病。家系2與TBMN連鎖的單體型為（PAX31D2S4012），家系3與TBMN連鎖的單體型為（PAX33D2S4015）。1與2號染色體上COL4A3COL4A4基因連鎖的3個TBMN家系2家系1D2S401PCR產物電泳結果(硝酸銀染色)MPBR322Hae22基因突變

15、研究9例TBMN患者均無Alul酶切位點，沒有發現文獻報道的GA（GlyGlu）的點突變（3）。3Alul酶切9例TBMN患者和2例正常人PCR產物后電泳結果9例TBMN患者和2例正常對照均無Alul酶切位點。MPBR322Hae，條帶19為9例TBMN患者，條帶1011為2例正常對照3討論腎小球基底膜的主要結構成分是型膠原，型膠原是由三條鏈形成的一種三螺旋網狀結構，目前已知構成型膠原的鏈有6種，分別為16，編碼6種鏈的基因以頭對頭的方式分別位于3條不同的染色體上，其中COL4A1和COL4A2位于13號染色體，COL4A3和COL4A4位于2號染色體，COL4A5和COL4A6位于X染色體。

16、1996年Lemmink首次用基因連鎖分析的方法對一常染色體顯性遺傳的荷蘭TBMN家系進行了研究，結果表明TBMN與位于2q35-37的COL4A3COL4A4基因連鎖，并在COL4A4基因上發現一由GA（GlyGlu）的點突變。由于甘氨酸在型膠原膠原區GlyXY重復序列結構中是分子量最小的足以進入三螺旋結構中心的氨基酸，膠原區每三個氨基酸就有一個甘氨酸重復序列結構的出現，對于維持三螺旋結構的穩定性是很重要的，如果甘氨酸被體積更大的氨基酸如谷氨酸代替，必將影響型膠原三螺旋結構的穩定性。這是關于TBMN發病機制的首例報道，至今尚未見類似報道2。運用與2號染色體上COL4A3COL4A4基因緊密連

17、鎖的微衛星標志PAX3和D2S401，本研究對9個TBMN家系進行了基因連鎖分析，結果表明3個常染色體顯性遺傳家系的TBMN與位于2號染色體上的COL4A3COL4A4基因連鎖，座位間的lodscore為3.1，0.00，可確定連鎖。本研究未在TBMN患者COL4A4基因上發現Lemmink報道的GA（GlyGlu）的點突變，分析可能有以下兩方面的原因： 研究的病例太少； TBMN可能和Alport綜合征(AS)相似，在多個位點存在著多種突變類型，故對于TBMN患者COL4A4基因上可能發生的突變，還應進行更深入的研究。本課題為國家自然科學基金資助項目（課題號3970353）作者單位：北京醫科

18、大學第一臨床醫院腎內科（北京，100034）朱世樂章友康現在武警總醫院腎內科張承英參考文獻1章友康，周蓉，王素霞等薄基底膜腎病27例研究中華內科雜志，1997，36：7362Lemmink HH，Nillesen WN，Mochiznki T et alBenign familial hematuria due to mutation of the mutation of the type collagen 4 gene J Clin Invest，1996，98：11143  Yamazaki H， Nakagawa Y， Saito A et al No linkage to the COL4A3 gene locus in Japane