1、人參皂苷Rb3對大鼠局灶性腦缺血損傷的保護作用(一)作者：胡瑜，陳浩凡，臧林泉，巫瑋【摘要】 目的 探討3種人參皂苷Rb3對大鼠局灶性腦缺血損傷的保護作用。 方法 將48只大鼠隨機分成6組：假手術組、模型組、人參皂苷Rb3 20、40、80mg/kg組和陽性對照藥血栓通注射液(XST)組；采用插線法使大腦中動脈閉塞（MCAO）建立大鼠局灶性腦缺血模型，于造模24 h后進行行為學評分，測定腦組織含水量以及腦組織中超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量，計算腦梗死面積百分比，并進行組織病理學檢查。結果 人參皂苷Rb3 40、80 mg/kg能明顯緩解腦缺血大鼠的行為學癥狀，減輕其腦水腫程度

2、，降低血清中MDA含量，升高SOD含量，并能減少其腦梗死面積，減輕組織病理學損傷。結論 人參皂苷Rb3對大鼠局灶性腦缺血損傷有較明顯的保護作用。 【關鍵詞】 腦缺血； 大腦中動脈閉塞（MCAO）；人參皂苷Rb3Protective effects of ginsenoside Rb3 on focal cerebral ischemic injury in ratsAbstract:Objective To study the protective effects of ginsengoside Rb3 on focal cerebral ischemia in rats.Methods 48

3、 SD rats were divided randomly into shamoperated group, model group, ginsenoside Rb3 (20, 40 and 80 mg/kg) group and positive control drug (XST) group. The model of focal cerebral ischemia was made by middle cerebral artery occlusion (MCAO) with nylon suture; neuroethological scores were gotten 24 h

4、 after the development of the model. The water content of brain tissue, the activities of SOD and MDA in brain tissue and were measured, the percentage of cerebral infarction area to total brain area was calculated, and histopathological examination was conducted. Results Ginsenoside Rb3 (at 40 mg/k

5、g and 80 mg/kg) could significantly reduce the scores for neurological deficits and brain edema, improve the activities of SOD, lower the content of MDA, reduce the cerebral infraction area, and alleviate the cerebral ischemia injury. Conclusion Ginsenoside Rb3 had obvious protective effects on the

6、focal cerebral ischemia in rats.Key words:brain ischemia;middle cerebral artery occlusion (MCAO);ginsenoside Rb3腦卒中是造成人類致死和致殘三大原因之一，腦對缺血缺氧極為敏感，腦缺血會引起腦組織不同程度的損傷，嚴重者影響中樞神經系統的功能。目前對缺血性腦卒中神經元損傷的機理進行了深入的研究1，認為自由基的生成增加、中性粒細胞及巨嗜細胞的聚集、蛋白溶解酶的釋放以及再灌注后血腦屏障的雙相性開放是腦缺血再灌注損傷的發病機制。另外血腦屏障完整性在腦缺血后再灌注中發揮重要的病理生理作用：腦缺血再

7、灌注后可使腦梗死及血腦屏障的破壞加重，且血腦屏障的破壞與腦血流的恢復存在相關性，局灶性腦缺血早期再灌注雖然有助于保護半暗區組織，但遲發性再灌注可加重腦損傷。腦梗死早期予以溶栓恢復缺血區腦血流可以減輕缺血性損傷，然而延遲再通可增加出血轉化及腦水腫的危險2，這限制了溶栓治療的應用與推廣。因此開發防治腦組織缺血性損傷的藥物，延長血流再通的有效時間窗是有待解決的問題，也一直是相關學科研究的重點之一。人參皂苷是人參中的主要活性成分，到目前為止已確定了結構的皂苷單體至少在40 種以上。有關人參皂苷抗腦缺血損傷作用的報道雖然已有不少，但一般都是用人參總皂苷或人參二醇組皂苷，二者均是多種單體的混合成分，其作用

8、的強弱和其所含單體的不同有關3。因此，對人參皂苷單體的研究顯得極為重要。本實驗著重研究了人參皂苷單體Rb3抗腦缺血損傷作用。1 材料與方法1.1 藥品及試劑注射用人參皂苷Rb3 單體（50 mg/mL，由中山大學藥學院提供）,血栓通注射液(由廣東永康藥業有限公司提供，生產批號：0709011),氯代三苯基四氮唑（紅四氮唑或TTC）(Fluka公司產品),SOD和MDA檢測試劑盒(南京建成生物工程公司產品)。1.2 實驗動物分組及給藥方法雄性清潔級SD大鼠（購自廣東省醫學實驗動物中心,合格證號：2006A064），體質量230280 g，隨機分成：假手術組、模型對照組、人參皂苷Rb3低劑量組、人

9、參皂苷Rb3中劑量組、人參皂苷Rb3高劑量組和血栓通注射液組，每組8只。于術前5 d每天1次分別給各組腹腔注射：人參皂苷Rb3低劑量20 mg/kg, 人參皂苷Rb3中劑量40 mg/kg, 人參皂苷Rb3高劑量80 mg/kg, 血栓通注射液0.45 mL/kg, 造模前0.5 h靜脈注射給藥1次；造模后4 h和10 h再分別進行腹腔注射給藥。模型組和假手術組大鼠給予生理鹽水，給藥時間及體積同上。1.3 動物模型制備取0.235 mm尼龍漁線，截作每段8 cm左右，頭端0. 5 mm加熱成光滑的球形,距插入端10 mm、18 mm、20 mm三處分別用標記筆作標記，75%()乙醇處理后置生理

10、鹽水中備用。1.3.2 手術方法將大鼠用10%()水合氯醛3.5 mL/kg 腹腔注射麻醉，頸部正中切口,分離左側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)，并分離翼額動脈（PPA）。在頸內動脈近端備線、遠端放置動脈夾，頸總動脈近分叉處切口，插入拴線，插至稍感阻力時即可，其深度為1720 mm，動脈外用手術線綁扎固定。栓線進入頸內動脈，入顱至大腦前動脈，阻斷大腦中動脈所有血流來源。傷口和腹腔均注入少量抗生素后，縫合皮膚，回籠飼養。造模成功的標準：術后24 h，每只取手術側腦小片進行TTC染色，變白色者為模型成功；動物手術后有明顯手術側（即左側）Horner癥（左側眼瞼下垂，眼球

11、凹陷）及手術側（即左側）偏癱體征（不能完全伸展左前肢，行走時向左側傾倒或轉圈）。1.4 行為學評分按照Longa 4 神經功能缺損評分法進行評分,0 分: 無神經損傷癥狀;1 分: 不能完全伸展對側前爪;2 分: 向對側轉圈;3 分: 向對側傾倒;4 分: 不能自發行走, 意識喪失。神經功能缺損評分時間點同上。1.5 腦含水量測定神經病學評分后，快速斷頭取鼠大腦。取左側半腦后半部分分別稱濕重，置120 烤箱烘干至恒重，按以下公式計算腦組織含水量，腦組織含水量(%)（濕重干重）/濕重100。1.6 腦組織勻漿測定超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的含量腦組織勻漿液的制備:迅速斷頭取腦,取

12、左側半腦前小部分放于液氮中保存待測。從液氮中取出半腦稱取100 mg,后置于9倍的生理鹽水中,用研磨器于冰塊上研磨,制成100%(/)腦勻漿液, 3 500 r/min,離心10 min。檢測方法：MDA測定采用硫代巴比妥酸法, SOD活力檢測采用黃嘌呤氧化法。1.7 腦梗死范圍的測定造模后24 h大鼠，快速取全腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，冰凍25 min。然后行冠狀切面取大腦中間一片，迅速置1紅四氮唑（TTC）中，避光，37 溫孵20 min，其間每隔78 min翻動一次，染色后以4多聚甲醛固定。染色結果：正常組織呈紅色，損傷梗死組織呈白色。拍照后以稱重法計算腦梗死面積百分比。1.8 病理

13、檢查造模后24 h大鼠腦，于視交叉處行冠狀切面取左側腦中間一小片放入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液保存超過48 。每個組織塊均以乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片厚約4 ，進行蘇木素伊紅(HaematoxylinEosin，HE)染色。光鏡下觀察腦組織病理學變化。1.9 統計學處理各組數據以均數標準差(s)表示, 運用SPSS13.0統計軟件進行資料t檢驗，P0.05為差異有顯著性。表1 對大鼠神經行為學評分的影響與假手術組比較：P0.01；與模型組比較：*P0.05，*P0.012 結 果2.1 行為學評分由表1可見，與模型組比較，人參皂苷Rb3 40、80 mg/kg組神經功能缺損評分明顯降低，有明顯

14、統計學差異（P0.05）。2.2 對腦缺血大鼠腦含水量的影響由表2可見，腦缺血24 h大鼠腦含水量明顯升高，與假手術組比較差異有顯著性（P0.01）。與模型組比較，人參皂苷Rb340、80 mg/kg組腦含水量明顯降低，差異有顯著性（P0.01）。2.3 腦組織中SOD和MDA含量表2 對腦缺血大鼠腦含水量的影響與假手術組比較：P0.05;與模型組比較：*P0.01表3 對腦缺血大鼠腦組織中SOD和MDA含量的影響與假手術組比較：P0.05;與模型組比較：*P0.05，*P0.01 由表3可見，與假手術組比較，模型組腦組織中超氧化物歧化酶（SOD）含量明顯升高，丙二醛含量明顯降低，與模型組比較

15、差異有顯著性（P0.01）。人參皂苷Rb3 40、80 mg/kg組腦組織中MDA含量明顯低于模型組，差異有顯著性（P0.05）。人參皂苷Rb3各劑量組腦組織中SOD含量均高于模型組，差異有顯著性（P0.01）。2.4 對腦缺血大鼠腦梗死面積的影響表4 對腦缺血大鼠腦梗死面積的影響與假手術組比較：P0.05;與模型組比較：*P0.05由表4可見，人參皂苷Rb340、80 mg/kg組腦梗死面積均明顯小于模型組，差異有顯著性（P0.05）。2.5 腦組織形態學變化大鼠經腦梗死術后24 h，病灶側腦表面蒼白、無光，腦表面血管較對側充血，顏色變暗。鏡下可見左半腦組織主要呈缺血性病理改變，經藥物治療后

16、充血腦組織缺血程度減輕。假手術組無明顯缺血性病理改變。各實驗組大腦組織病理學改變如下：假手術組：神經元的大小和形態結構基本正常，無明顯水腫；神經細胞的胞漿豐富，核膜清楚，核仁清晰；神經膠質細胞核仁清晰，腦漿通亮或淡染，小血管、毛細血管周圍間隙極小。模型對照組：腦組織病變區域，間質疏松，明顯水腫；水腫區域的神經細胞、神經膠質細胞、小血管及毛細血管周圍間隙明顯變寬，多數細胞腫脹變形、著色加深；胞漿、胞核界線明顯不清，部分胞核固縮明顯，呈三角形，核膜結構模糊，核仁不清或消失。可見有腦組織毛細血管充血，有少量紅細胞外漏至腦組織，可見炎癥細胞浸潤。人參皂苷治療各組：比模型組病變有明顯改善，腦組織神經細胞

17、、神經膠質細胞、小血管及毛細血管周圍間隙略變寬，皮層細胞變性程度明顯減輕，部分細胞輕度或中度腫脹，胞核和胞漿有些不清，核仁比較模糊。以高、中劑量改善較明顯。血栓通組也有明顯的改善。3 討 論關于局灶腦缺血動物模型已有很多報道5， 目前一致認為選用大鼠具有成本低、種系純合性好, 與人類有類似的腦血管解剖特點等優點, 是最常選用的實驗動物。此外, 大鼠抗感染能力較強, 生命力也強, 實驗中動物感染較少, 存活時間相對較長。關于神經系統體征評分與梗死體積的相關性研究, 國外早有報道。Bederson認為神經系統體征評分與梗死體積有明顯的相關性6,7。本研究結果也證實，神經學評分越高出現梗死灶就越明顯

18、。本研究選用SD大鼠復制MCAO大鼠模型，觀察人參皂苷Rb3對缺血性腦中風的防治作用。實驗結果表明，模型組偏癱體征典型，腦水腫癥狀明顯，腦梗死面積廣泛，表明本實驗模型建立成功。而人參皂苷Rb3中、高劑量可改善中動脈栓塞所致局灶性腦缺血大鼠的神經功能,明顯縮小梗死面積、減輕腦水腫，顯著降低中動脈栓塞大鼠大腦組織中的MDA 含量,增加SOD 含量。病理切片也表明人參皂苷Rb3可明顯改善局灶性腦缺血時大鼠的腦代謝；維持腦缺血狀態下神經細胞的正常形態和功能,延緩、減輕其壞死，表明人參皂苷Rb3 對大鼠腦缺血有較明顯的保護作用。缺血性腦損傷的機制研究中8，9，興奮性氨基酸假說、鈣超載相關假說和自由基假說

19、之間是相互聯系的。腦缺血時，首先是三磷腺苷耗竭，膜去極化，L型電壓門控鈣通道活化,Ca2內流,促使谷氨酸大量釋放。后者結合突觸后膜受體引起NR過度激活，導致胞內Ca2超載，激活包括磷脂酶在內的Ca2靶酶，膜磷脂水解，經代謝產生自由基，進一步使質膜和生物大分子破壞，導致缺血灶周邊區神經元凋亡。腦缺血損傷時血小板活化因子合成顯著增多，已證實在缺血的神經組織中血小板活化因子水平較正常高20倍，血小板活化因子通過使腦細胞內鈣超載，參與一系列炎癥反應，在缺血再灌注期產生自由基，使電解質平衡和能量代謝發生障礙，通過脂質過氧化致生物膜裂解導致神經細胞損傷，血腦屏障破壞，并可和其他細胞因子相互作用，加重腦細胞損傷。此外，血小板活化因子可使腦內興奮性氨基酸增加，與突觸后的N甲基D天冬氨酸受體結合，引起Ca2超載，并可致Ca2內流，加重腦細胞水腫，加重腦損傷。血小板活化因子還可引起腦血管收縮，使腦血量減少；能損傷內皮細胞使血管通透性增加，血腦屏障通透性增高；能激活白細胞引起氧自由基及白三烯形成；有很強的促血小板聚集作用等，從而在腦缺血、繼