1、Chinese Journal of New Drugs 2011, 20(19基金項目 國家 “ 重大新藥創(chuàng)制 ” 科技重大專項 (2009ZX09307-001 ; 國 家 高 技 術 研 究 發(fā) 展 計 劃 (863計 劃 (2007AA021601, 2007AA021204作者簡介 高凱 , 男 , 博士 , 副研究員 , 主要從事生物技術藥物質量 控制研究 。 聯(lián)系電話 :(010 67095684,E-mail :gaokainicpbporgcn 。 通訊作者 王軍志 , 男 , 研究員 , 博士生導師 , 主要從事生物技術藥 物的質量控制和質量標準研究 。 聯(lián)系電話 :(01

2、0 67095380, E-mail :wangjznicpbporgcn 。·重大新藥創(chuàng)制專項巡禮 ·重組抗體藥物的質量控制高凱 , 陶磊 , 王軍志(中國食品藥品檢定研究院重組技術產品室 , 北京 100050摘要 重組抗體藥物是生物工程關鍵技術的前沿成果 , 在腫瘤 、 自身免疫 、 器官移植和感染性疾病的 治療中均取得了顯著療效 , 在生物技術藥物市場中的比重也在迅速攀升 。 作為生物技術產業(yè)化領域最成功 的產品之一 , 如何通過質量控制確保抗體藥物的安全有效一直是本領域的關注熱點 。 文中就重組抗體藥物 質量控制的關鍵環(huán)節(jié) 、 進展及未來需要進一步開展的工作作一簡

3、要綜述 。關鍵詞 生物技術藥物 ; 重組抗體 ; 質量控制 中圖分類號 R917文獻標志碼 A 文章編號 10033734(2011 19184808Quality control for recombinant therapeutic antibodiesGAO Kai , TAO Lei , WANG Jun-zhi(Division of Biopharmaceuticals , National Institutes for Food and Drug Control , Beijing 100050, China Abstract Recombinant therapeutic an

4、tibodies are one of the great achievements of modern biotechnologyThere is no doubt that the uses of recombinant therapeutic antibodies were successful in treating various life-threat-ening and chronic diseases , including cancer , autoimmunity , transplantation and infectious diseasesIts share in t

5、he global biopharmaceutical market also increased rapidly in recent yearsMeanwhile , as one of the most success-ful outcome biotherapeutics ,how to ensure the safety and efficacy of recombinant antibody products through well es-tablished quality control system is always the focus of attention from b

6、oth the views of regulatory authorities and in-dustriesThis article briefly reviewed the key points , research progress for the control of recombinant antibodies , as well as raised further work on quality control issuesKey words biopharmaceutics ; recombinant therapeutic antibodies ; quality contro

7、l 藥品的質量源于設計 , 而非依賴終產品的檢 測 1, 重組抗體藥物也不例外 。 廣義的質量控制包 括生產過程控制 、 終產品質量控制等環(huán)節(jié) 。 抗體由 兩條重鏈和輕鏈以鏈間二硫鍵形成連接 , 結構復雜 、 相對分子質量大 , 采用哺乳動物細胞表達體系制備 通常含有翻譯后修飾 , 與原核體系制備的生物技術 產品相比 , 其質量控制難度相對較大 。 重組抗體藥物的生產過程包括工程細胞的構建及傳代擴增 、 細胞培養(yǎng) 、 抗體的純化 、 產品分裝保存等 。 因此生產單 位需遵循藥品生產質量管理規(guī)范 (GMP 的總體要 求建立質量體系 , 并通過質量保證部門對生產過程 實施全程監(jiān)控才能確保終產品的安

8、全有效 。 鑒于抗 體藥物生產過程與其他生物技術藥物類似 , 本文未 對抗體藥物生產的過程控制進行闡述 (相關內容可 參見國家食品藥品監(jiān)督法規(guī)與 ICH 指導原則等 , 而主要側重于介紹重組抗體藥物生產細胞 、 質控用 標準物質 、 產品質量控制方面的研究進展 。 1生產細胞的質量控制重組單抗的生產細胞應來自于共同的原始細 胞 , 具有相同的遺傳和生物學特征 , 經全面檢測無病 源微生物污染 , 在特定的培養(yǎng)條件下 , 可以穩(wěn)定持續(xù)地表達結構正確并具有生物學活性的抗體 2。 Chinese Journal of New Drugs 2011, 20(19184919期11工程細胞的構建 首先應

9、清楚所采用細胞系的來源及培養(yǎng)歷史等有關背景資料 , 包括細胞種屬及地域來源 、 病原體檢 測結果 、 最初分離培養(yǎng)和建系信息 、 采用的方法與原 材料等 。 在構建中應說明構建和篩選的手段與步 驟 、 克隆基因的序列 、 插入載體目的基因編碼區(qū)和相 關側翼序列 , 說明載體引入細胞的方法及載體在細胞 內的狀態(tài)與拷貝數(shù) , 并應提供宿主和載體結合后的遺 傳穩(wěn)定性資料 。 同時還應明確細胞的生長特征 、 培養(yǎng)條件 、 培養(yǎng)液組成 、 導入目的基因的表達水平等34。 12細胞庫的建立細胞庫的建立可為重組抗體藥物提供質量穩(wěn)定以及能持續(xù)傳代的細胞種子 , 從而確保抗體藥物生 產的批間一致 。 與其他生物

10、技術藥物的要求類似 , 抗體生產的細胞庫為三級管理 , 即原始細胞庫 、 主細 胞庫及工作細胞庫5。原始細胞庫是由一個原始細胞群體發(fā)展成傳代 穩(wěn)定的細胞群體或經過克隆選擇而形成的均一細胞群體 。 主細胞庫 、工作細胞庫則分別由原始細胞庫 和主細胞庫經傳代后均勻混合而成 。 其中主細胞庫最多不得超過 2個細胞代次 , 同時限定工作細胞庫 代次 。 工作庫凍存時細胞的傳代水平須確保復蘇后 傳代增殖的細胞量能滿足生產一批制品 。 復蘇后細 胞的傳代水平不應超過批準用于生產的最高限定代次 。 細胞庫的管理要求建立臺賬 ,每支細胞有明確 標記 , 包括名稱 、 代次 、 批號 、 凍存日期等 。 主庫和

11、工作庫應分別存放 , 非生產用細胞應與生產用細胞嚴 格分開存放 。 上述各級種子庫的細胞應按照特定的 要求經過全面檢定合格后方可使用 。 13細胞檢定抗體藥物的生產細胞檢定包括鑒別 、 病源微生 物 、 致瘤性等檢查 , 同時以基因工程技術構建的重組 抗體生產細胞 , 還應包括特異的鑒別試驗與細胞基質穩(wěn)定性內容 6。 131細胞鑒別細胞鑒別可通過形態(tài) 、生化方法 (同工酶等 、 免疫學檢測 (組織相容性抗原等 、 遺傳學檢測 (染色體核型等 7、 遺傳標志檢測 (DNA 指紋圖譜等 等方法 , 并應采用不同方法進行聯(lián)合檢測 。 抗體基因或 其 表 達 產 物 可 通 過 PCR 、 限 制 性

12、 內 切 酶 譜 、Southern 雜交以及免疫印跡等方法進行鑒別 。 建庫 后應對主庫和生產終末細胞進行全檢 , 同時新建的 工作庫細胞也需按規(guī)定要求進行檢定 。132病源微生物檢測 該項檢測包括無菌 、 支原體 、 細胞內 、 外源病毒因子檢查 。 其中病毒檢測的種類及方法須根據(jù)細胞的種屬來源及細胞特性決定 8。 通常病毒因子可 通過細胞形態(tài)觀察 、紅細胞吸附試驗 、 不同細胞傳代 培養(yǎng)法及接種動物和雞胚法檢測 , 其中 , 中華人民 共和國藥典 2010年版三部中新增規(guī)定 :用不同細 胞傳代培養(yǎng)法檢測病毒因子時 , 應設立可觀察細胞 病變的病毒陽性對照及血吸附陽性對照 。 對于重組 工

13、程細胞來說 , 還應當對細胞裂解物或收獲液進行 外源因子檢測9。對于逆轉錄病毒及其他內源性病毒或病毒核酸的檢測 , 可采用逆轉錄酶活性測定 、 透射電鏡以及感 染性試驗方法 。 根據(jù)待檢細胞系的種屬及組織來 源 , 還應進行特殊外源病毒因子的檢測 。 如鼠源細 胞系 , 需檢測出血熱病毒 、 淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病 毒 、 呼腸孤病毒等 ; 如為人源細胞系 , 應檢測鼻咽癌 病毒 、巨細胞病毒 、 乙型 、 丙型肝炎病毒等 。 133致瘤性檢查致瘤性檢查可通過裸鼠和新生小鼠體內試驗以 及軟瓊脂克隆形成等體外方法進行 。 目前重組抗體 生產的 CHO 等細胞株已證明具有致瘤性 , 通常不再 要求

14、進行該項檢查 , 但也有觀點認為插入抗體等特定 基因序列的重組工程細胞應當被視為全新細胞 , 須進行致瘤性檢查 ,并在傳代 /擴增過程中進行試驗對比 , 觀察致瘤性特征的改變 。 基于安全性考慮 , 還需要優(yōu)化抗體藥物的純化工藝 , 并在終產品的放行中嚴格限 量控制殘余 DNA 等具有潛在致瘤性風險的組分 。 134細胞基質的穩(wěn)定性作為經 DNA 重組技術獲得的含有特定基因序 列的重組抗體生產細胞 , 生產者還須具有細胞基質 的穩(wěn)定性資料 , 包括重組細胞的遺傳穩(wěn)定性 、 目的基 因表達穩(wěn)定性 、 目標產品持續(xù)生產的穩(wěn)定性 , 以及在 保存時細胞生產抗體產品能力的穩(wěn)定性等資料 9。2質量控制標

15、準物質標準物質和檢測方法是抗體藥物質量控制的兩個重要技術支撐點 , 而性質穩(wěn)定均一的標準物質是 方法學建立中必不可少的重要因素 。 包括抗體在內 的生物大分子的結構決定其功能 , 因此其質控標準 物質也包括理化對照品及活性標準品 。 21標準物質的制備標準物質的均一 、 穩(wěn)定至關重要 。 因此原料需進行全面的質量分析 ,甚至在部分關鍵質控項目上 Chinese Journal of New Drugs 2011, 20(19的標準應高于產品 。 原料的選擇應遵循與供試品相 同的原則 , 其配方研究要在基于不干擾測定結果的 前提下 , 盡可能提高穩(wěn)定性 。 理化對照品在經過全 面的分析和鑒定后

16、, 主要在常規(guī)質控中用于結構和 翻譯后修飾的確證 。 活性標準品則通過協(xié)作標定進 行賦值 。 安瓿分裝凍干后熔封的制備方式因其良好的氣密性是標準物質制備的首選 10。 標準品的分 裝應在潔凈環(huán)境下進行 , 在保持條件一致的前提下 ,于分裝前 、 中 、 后階段以相同時間間隔抽樣進行分裝精度控制 ( 10% , 凍干后還應進行無菌 、 水分等檢測 , 通常標準物質的殘留水分應 30%11, 但該指標與穩(wěn)定性相關 , 因此應盡量降低標準物質中水分的殘留量 。抗體質控標準物質一般進行冷藏或低溫冷凍保 存 , 其有效期需根據(jù)穩(wěn)定性評價確定 。 穩(wěn)定性研究包括熱加速試驗 、 期間核查及長期 穩(wěn)定性試驗

17、。 熱加速試驗是通過在不同溫度條件下 加速樣品的化學降解或物理變化 ,通過熱動力學參 數(shù)與數(shù)學模型分析預測標準物質在既定儲存溫度下的活性 、 含量變化 。 長期試驗則是指在既定的保存 條件下進行的實時穩(wěn)定性監(jiān)測 。 為反映出標準物質 穩(wěn)定性特征的全貌 , 應設定多個指標進行評價 , 如效價 、 純度 、 含量等 12。 22理化對照品正確的結構是重組抗體發(fā)揮其生物學功能的基 礎 。 理化對照品不僅是建立抗體藥物質控標準的前提和基礎 , 而且還可簡化常規(guī)質控方法 , 無需涉及質 譜等大型分析儀器 , 通過產品與理化對照的比對分 析 , 即可發(fā)現(xiàn)產品結構是否存在異常 。 理化對照品結 構的全面鑒定

18、一般包括質譜相對分子質量測定 、 末端 氨基酸序列測定 、 液質肽圖或肽指紋圖譜分析 、 二硫鍵 配對方式以及代表翻譯后修飾的糖基化分析等 13。221質譜相對分子質量測定抗體由 4條肽鏈組成 , 且 Fc 段具有糖基化修飾 , 可直接測定完整抗體的相對分子質量 , 也可以用 糖苷酶切除糖基后再測定抗體蛋白部分的相對分子 質量 , 或者以還原劑將二硫鍵打開后分別測定抗體 輕 、 重鏈相對分子質量 。 目前質譜相對分子質量測 定主要采用電噴霧離 子 化 (electrospray ionization , ESI 及基質輔助激光解析離子化 (matrix-assisted la-ser deso

19、rption ionization , MALDI 等離子源 。 蛋白離 子化后 , 通過質量分析器測定其質荷比計算相對分子質量 ,并與理論相對分子質量進行比較 , 以初步驗 證抗體結構是否正常 。222末端氨基酸序列測定末端氨基酸序列測定也是抗體一級結構鑒定的 方式之一 。 通常 N-末端氨基酸測定以 Edman 降解 法最為常用 。 由于抗體的特殊結構 ,測序時須首先 將二硫鍵還原 , 并以適當?shù)姆椒▽⑤p 、 重鏈分離后再 測定 。 如果抗體的 N-末端存在封閉 , 則需針對封閉 類型 , 采用相應方法去封閉后再按上述程序進行測 定14。 常見封閉形式及去封閉方法見表 1。表 1常見 N-

20、末端封閉形式及去封閉方法封閉基團 修飾殘基去封閉方法 甲酰基 甘氨酸 、蛋氨酸 酸水解 , 肼解乙酰基絲氨酸 、 丙氨酸 、 蛋氨酸 、 甘氨酸 、 谷氨酸 、 蘇氨酸 、 纈氨酸 、 脯氨酸酸水解 , 肼解 焦谷氨酰 谷氨酸 、 谷氨酰胺 焦谷氨肽酶水解目前 C-末端氨基酸序列測定可采用酶法或化學法收集 C-末端肽后 , 再以 N-末端測序方法進行 ; 也可以直接對收集的 C-末端肽段進行串聯(lián)質譜分析 。 此外 , 還可通過質譜儀測定被羧肽酶酶解后獲 得的 C-末端長短不一肽段的相對分子質量 , 并根據(jù)相鄰相對分子質量的差值確定 C-末端序列 1516。 223液質肽圖或肽質量指紋圖譜分析為

21、了進一步鑒定重組抗體的一級結構 , 可進行液質肽圖或肽質量指紋圖譜分析 。 液質肽圖是將抗 體用蛋白酶酶解為肽段后 , 先經色譜分離后再以質 譜檢測 , 通過相對分子質量測定結果與蛋白酶酶解 特性的綜合分析來確定各肽段的序列17。 而將酶解所得肽段直接進行質譜檢測則稱為肽質量指紋圖譜 。 液質肽圖的優(yōu)勢在于各肽段經過液相分離 后 , 在質譜相對分子質量測定時相互之間的干擾 較弱 , 但耗時較長 ; 而后者則適宜高通量分析 。 224二硫鍵分析IgG1型抗體中 , 共有 16條二硫鍵 , 正確配對的 鏈內 、 鏈間二硫鍵是維持重組抗體空間結構和發(fā)揮生物學功能的重要保障 。 二硫鍵的確定方式可采用

22、液質肽圖或肽質量指紋圖譜法 。 即在非還原條件 下 , 將重組抗體直接進行蛋白酶酶切 , 酶切后有些肽 段仍通過二硫鍵連接在一起 , 通過對這些肽段進行質譜鑒定即可驗證抗體的二硫鍵配對方式 18。 為 確保抗體的完全酶解 , 必要時可分別采用兩種或以上的蛋白酶進行酶切 , 并通過綜合分析對抗體二硫 鍵配對的方式進行鑒定 。 Chinese Journal of New Drugs 2011, 20(19185119期225糖基化分析糖鏈在維持抗體正常結構及與其他蛋白的相互作用中均發(fā)揮了重要作用 1920, 抗體 Fc 段的糖鏈改造可顯著改變其生物學活性2122。 因此在抗體 的質量控制中 ,翻

23、譯后糖基化修飾的分析是十分必 要的 。 目前主要包括寡糖圖譜 、 糖基化位點分析及糖鏈結構分析等 23。寡糖圖譜是對重組抗體藥物中不同修飾形式的 寡糖鏈所占比例的分析 。 即將糖苷酶從抗體上切下 的糖鏈衍生 、 純化后 , 再以液相色譜分析確定各寡糖 鏈所占的比例 。 寡糖多樣性形式的進一步分析 , 可結 合文獻資料并采用相應的寡糖參考品進行綜合比對 。抗體的糖基化主要有 N-糖與 O-糖兩種 , 位于 N-糖還原端的 N -乙酰葡糖胺 (GlcNAc 與抗體中的天冬酰胺 (Asn 的酰胺氮以 1, 4糖苷鍵相連 , 且 糖基化 位 點 處 有 特 殊 的 序 列 子 結 構 “ Asn-X-

24、Ser /Thr ” , 其中 “ X ” 為除脯氨酸 (Pro 外的任意氨基酸 , 只有該序列子中的 Asn 才有可能發(fā)生 N-糖基化 。 O -糖雖無特殊序列子結構 , 但可與抗體中絲氨酸 (Ser 或蘇氨酸 (Thr 的羥基相連 24。 糖基化位點 可通過切除糖鏈前 、 后的液質肽圖或肽質量指紋圖 譜的方法確定 , 通過對圖譜中相對分子質量的差異 肽段進行分析 , 即可確定糖基化位點 。糖鏈結構分析目前有多種方法 :可通過測定糖 鏈的相對分子質量結合已有的文獻資料對糖鏈結構進行預測 25; 也可通過串聯(lián)質譜的方法測定糖鏈結 構26; 或結合多種糖苷酶對糖鏈進行分步酶切測定單糖的連接方式

25、26等 。23生物學活性測定標準品活性測定是抗體質量控制的重要環(huán)節(jié) 。 生物學 活性測定標準品同樣需要遵從材料均勻 、 性質穩(wěn)定 的要求 , 同時還需要進行準確的賦值 。 重組抗體質 控用活性標準品的制備 、 穩(wěn)定性評價同上所述 。 通 常其凍干制備過程中需要添加穩(wěn)定劑或賦形劑等輔 料 , 但可通過提高活性成分的分裝量 , 并在梯度稀釋 進行活性測定前 ,以提高預稀釋倍數(shù)的方式將輔料 對活性測定的干擾降至最低 。 雖然目前大多數(shù)抗體 生物學活性測定是通過供試品與活性標準品 EC 50值的比較確定的相對活性 , 即沒有對生物學活性測 定標準品進行賦值 , 但如果在儲存過程中供試品 、 活 性標準

26、生物學活性降低的速率和趨勢一致時 , 以百 分含量表示的相對生物學活性是無法客觀反應樣品有效性的變化的 ,因此其標準品賦值可借鑒其他生 物技術藥物活性測定標準品的方式 ,即在確定的實 驗條件下 , 將其 EC 50值對應的重量單位定義為一個 生物學活性單位 , 并通過協(xié)作標定研究進行賦值 。協(xié)作標定一般至少選擇 3家以上實驗室參與 , 被 邀請單位需要具備相關的實踐經驗 , 不包括預試驗在 內 , 每家單位應能提供符合要求 、 不同日期進行的至 少 3次獨立試驗結果 。 協(xié)作標定需按統(tǒng)一的方法進 行 , 方法應包括樣品復溶 、 稀釋 、 樣品排列順序等具體 的操作步驟 , 按統(tǒng)一的方式計算后

27、, 借助統(tǒng)計學方法合并處理結果并對活性測定標準品進行賦值 27。 3重組抗體產品的質量控制重組抗體產品的質量控制根據(jù)相關法規(guī) 、 指導 原則的要求及產品自身特性 , 其原液檢定主要包括 各種理化分析 、 活性測定 、 殘留雜質分析等 , 成品除 包括含量與活性測定外 , 還需要對安全性和注射劑 的常規(guī)項目進行質控 2830。31理化分析 311結構確證抗體藥物批檢驗的常規(guī)質控中 , 針對結構的理化分析主要包括 N-末端氨基酸序列 、 肽圖 、 糖基化 分析等測定等 , 并通過引入已全面分析的理化對照品進行比對 , 因此在常規(guī)批檢驗質控中 , 將簡化結構 鑒定的工作量 。 N-末端氨基酸測定同理

28、化對照品 。 在肽圖分析中 , 由于抗體的空間結構復雜 、 緊密 , 導 致蛋白酶酶解的效果不理想 ,因此在蛋白酶酶解前 , 一般先采用化學或物理方法將抗體變性后 , 再以二 硫蘇糖醇等還原劑打開二硫鍵 , 并對還原后的游離 巰基進行烷基化保護 , 按上述相同條件制備的樣品 與理化對照品酶解將更完全 , 同時后續(xù)的 HPLC 分 離也將獲得較理想肽圖 。 為避免糖鏈對肽圖測定的 影響 , 有時還需要在酶解前先將其切除 。 糖基化分 析根據(jù)抗體藥物自身的理化特性 , 結合理化對照品并 通過唾液酸含量 、 寡糖圖譜分析等方式進行控制 , 并 可依據(jù)供試品唾液酸 、 各寡糖峰面積與對照品的相應 比例

29、進行判定 。 通過 N-末端氨基酸序列 、 肽圖 、 糖基化分析等測定 ,結合與理化對照品的比對 , 可以有效 確保生產工藝的穩(wěn)定及抗體藥物的批間一致 。312純度分析抗體藥物的純度直接反應了純化工藝水平及產 品質量的優(yōu)劣 。 為避免一種檢測方法在蛋白純度檢 測中的偏差 , 一般選用至少兩種不同原理的方法進 行檢測 , 以盡可能地分離相關雜質并得到相對準確 的純度結果 。 測定抗體純度的常用方法包括 SDS- Chinese Journal of New Drugs 2011, 20(19PAGE 法及毛細管電泳等方法 , 以及反相 、 分子排阻 和離子交換等高效液相色譜法 。 還原型 SDS

30、-PAGE 電泳是較常用的方法 , 標準一般規(guī)定輕 、 重鏈條帶含 量之和 950%。 液相色譜法進行純度測定時應選擇合適的色譜柱及流動相 ,避免在分析過程中抗體蛋 白沉淀掛柱 ; 在正式分析之前應充分平衡色譜柱并做空白對照 , 空白對照中應無雜峰出現(xiàn) ; 按面積歸一化 法計算主峰面積 , 一般不應低于總面積的 950%。 313蛋白含量測定蛋白含量測定目前常用的方法主要包括分光光 度法 、 Lowry 法 、 Bradford 法 、 BCA 法 、 凱氏定氮法等 。 除凱氏定氮法以外 , 其余方法的原理均與蛋白結構 和氨基酸組成相關 , 并且所需含量測定對照品要和 供試品一致31。 目前絕

31、大多數(shù)重組抗體的含量測定采用的是分光光度法 。 其消光系數(shù)是根據(jù) Edel-hoch 研究建立的色氨酸 、 酪氨酸 、 半胱氨酸模型化 合物在 6mol ·L 1鹽酸胍條件下 , 可被用于同等變性 條件下對其他非折疊蛋白消光系數(shù)進行估算的原理所確定 。 結合該變性消光系數(shù) ,再通過與不同濃度 天然蛋白 、 變性蛋白吸光值的校正計算即可獲得該目標蛋白的消光系數(shù) 32, 但該消光系數(shù)是通過模型 化合物以及與變性蛋白的比對分析估算獲得 。 目前 國外生物技術產品含量測定中 , 已多采用與供試品 具有相同結構的標準物質進行含量測定 , 但均無公 開的含量溯源資料 。 凱氏定氮通過含氮量分析進

32、行 蛋白含量測定 , 反應中消耗的標準酸滴定液可溯源至恒重無水碳酸鈉的重量 33, 因此無需其他蛋白標 準物質 , 可作為含量標準品溯源的方法 , 同時氨基酸 組成分析也是可供選擇的手段之一 。 314其他理化特性分析此類質控主要包括相對分子質量和等電點等指標 。 相對分子質量也主要采用還原型 SDS-PAGE 電 泳的方法 , 標準一般規(guī)定為理論相對分子質量 10%以內 , 并通過與理化對照的遷移率進行校正 。 等電聚焦電泳是重組抗體等電點測定的常用方法 , 其 pH 梯 度主要由兩性電解質建立 。 由于溶媒中存在的鹽會 破壞 pH 梯度 , 因此可采用透析 、 超濾 、 過柱等方法進 行脫

33、鹽 。 測定重組抗體的等電點時 , 由于其糖基化的 不均一使抗體所帶電荷不同 , 測定結果中會出現(xiàn)多個 電泳條帶 , 因此重組抗體的等電點測定結果通常為一 個 pH 范圍 , 并且應與已全面分析的理化對照品一致 。 32生物學活性生物學活性測定是確保重組抗體有效性的重要質控指標 。 抗體與其特異的靶點結合后 ,通過細胞 因子信號的阻斷 、 補體系統(tǒng)的活化 、 耦聯(lián)毒素殺傷等 生物學作用發(fā)揮重組抗體的治療功效 , 其生物學活 性測定主要是在體外建立相應的細胞評價模型 , 模 擬其作用機制產生客觀的全程量效反應 ,并通過與 活性標準品的比較對其生物學活性進行評價 。 根據(jù) 其作用機制主要分為補體依

34、賴的細胞毒法 、 細胞 /生 長因子信號通路阻斷后產生的殺傷活性中和或細胞 增殖抑制法 、 報告基因測定等方法 。 如無法建立特 異的細胞學量效反應模型 , 也可以測定重組抗體與 其作用靶點的結合能力作為其功能性的評價指標 , 主要測定方法包括 ELISA 法 、 流式細胞儀法和基于 表面 等 離 子 共 振 技 術 (surface plasmon resonance , SPR 的生物分子相互作用分析法 (biomolecular in-teraction analysis , BIA 等 。 321重組抗體的生物學活性測定3211補體依賴的細胞毒 (complement depend-e

35、nt cytotoxicity ,CDC 法 重組抗 CD20單抗的活性 測定即采用該方法 。 將重組抗體進行系列稀釋后與 表達 CD20的效應細胞結合 , 重組抗體與細胞表面 抗原形成抗原抗體復合物的過程中 , 使抗體空間結 構發(fā)生變化并暴露 Fc 段的補體結合位點 ; 通過與補 體的孵育及其級聯(lián)激活 , 完成攻膜復合物的裝配并 在細胞表面打孔 , 最終導致細胞溶解 。 細胞染色后 , 以抗體濃度對吸光度作圖 , 并以 4參數(shù)方程擬合曲 線可得到全程反應的 “ 反 S 形 ” 曲線 , 通過供試品與 活性標準品 EC 50值的比較即可對重組抗體的相對 活性進行計算和評價 。 3212信號通路

36、阻斷法細胞因子等激動劑需要與細胞膜上的受體結合 、 激活相應的信號通路后才能發(fā)揮其生物學效應 。 以此類細胞 /生長因子或 其受體為靶點的重組抗體的生物學活性可基于這一 特點建立相應的生物學活性測定方法 , 主要包括殺 傷中和活性或特異的細胞增殖抑制活性等 。以抗腫瘤壞死因子 -(TNF- 單抗為例 , 該重 組單抗能特異識別結合 TNF-, 并通過阻斷 TNF-與受體結合而拮抗 TNF-的細胞毒性 , 使其免受 TNF-誘導的凋亡 。 該抗體活性測定采用對 TNF-殺傷敏感的細胞系 , 將抗體做系列稀釋后與 TNF-共孵育 , 使抗體與 TNF-結合 。 待孵育結束后加入 對 TNF-殺傷敏

37、感的細胞進行培養(yǎng) , 未被中和的 TNF-將與細胞膜上的受體結合并誘導凋亡 。 通過對存活細胞的染色 、測定其吸光度值 , 將抗體濃度與 Chinese Journal of New Drugs 2011 ， 20 （ 19 ） 存活細胞 的 量 效 關 系 進 行 4 參 數(shù) 擬 合 后， 計算其 EC50 ， 并與標準品比較后即可評價抗體的相對活性 。 而表皮生長因子受體 （ EGFR ） 單抗的生物學活性測 定則是采用細胞增殖抑制方式， 即通過特異結合并 有效抑制腫瘤細胞生長， 并 封閉表皮生長因子受體， 通過供試品與標準品的梯度稀釋獲得增殖抑制的量 效曲線， 并計算重組抗體的生物學活性

38、。 3 2 1 3 報告基因法也是通過重組 抗體與相應靶點結合后， 測定信號通路變化效應的 活性評價方式。一般在細胞株難于獲得， 以及殺傷 中和或增殖抑制法產生量效曲線的信噪比不理想 時， 可基于對該通路的現(xiàn)有了解， 將攜帶抗體作用靶 點反應元件與報告基因的質粒穩(wěn)定轉染細胞后 ， 通 過重組抗體與相應靶點的作用， 啟動報告基因的表 達來檢測重組抗體的生物學活性 。如在 VEGF 單抗 將攜帶 VEGF 受體和螢光素酶報告 的活性測定中， 基因的質粒共轉染 293 細胞， 篩選后得到穩(wěn)定攜帶 上述質粒的細胞。當 VEGF 與該重組細胞膜上的受 體結合后， 可通過胞內結構域的變構與相應信號通 路的

39、作用， 活化螢光素酶報告基因的表達。 將系列 梯度稀釋的供試品與標準品與一定濃度的 VEGF 孵 育后， 與該重組細胞共培養(yǎng)即可獲得 VEGF 單抗的 1 單抗也采用了攜帶類似報告 活性量效曲線。IL基因的細胞株進行活性測定。 3 2 2 重組抗體的結合活性測定 3 2 2 1 競爭 ELISA 是最常用的重組 抗體結合活性測定方法。首先將制備的可溶性抗原 包被后， 將系列梯度稀釋的供試品、 標準品與一定濃 ， 度的酶標抗體競爭結合包被抗原 將抗體濃度與吸 光值的量效關系進行 4 參數(shù)擬合后， 計算供試品、 標 準品的 EC50 值評價重組抗體的結合活性。 3 2 2 2 流式細胞儀法 該方法

40、原理與競爭 ELISA 相同， 只是以帶有特異結合位點或膜表面標 ELISA 法 報告基因法 待測抗體通過微液流 片可固化可溶性的抗原和細胞， 系統(tǒng)流經芯片時， 一旦與固化抗原結合， 芯片表面的蛋 白濃度就會增加， 進而引起芯片表面液體折射率的變 化而被檢測到。BIA 技術的優(yōu)勢還在于能實時動態(tài)監(jiān) 并測定親和常數(shù)等反應參數(shù)。 測抗原抗體的結合反應， 3 3 殘留雜質 重組抗體一般由哺乳動物細胞表達生產， 因此 需要對制品中來自表達體系及純化過程中可能存在 的外源組分進行限量控制。 根據(jù)其生產工藝， 相關 雜質的限量控制主要包括殘余 DNA、 殘余宿主細胞 蛋白、 殘留蛋白 A 等。 其中針對宿

41、主細胞蛋白、 蛋 白 A（ 親和純化柱的配基 ） 的殘留限量檢測主要采 用夾心 ELISA 的方法。 傳代細胞系的 DNA 理論上具有致瘤性的潛在 FDA 將生物制品可以允許的殘余 DNA 限度 風險， 30 我國也規(guī)定須用敏 規(guī)定為每劑量不超過 100 pg ， 感的方法測定來源于宿主細胞 （ 包括轉化的哺乳動 其限量規(guī)定為每 物傳代細胞） 的殘余 DNA 含量 ， 劑量小于 100 pg。 目前殘余 DNA 的檢測方法主要 37 40 。 雜交 包括雜交、 熒光染色、 定量 PCR 等方法 法主要采用地高辛等非放射性材料標記核酸探針， 無 36 需特殊儀器設備， 但在實際工作中通常需要對供

42、試品 及 DNA 標準進行蛋白酶消化等同步處理， 會造成檢 測靈敏度的降低。熒光染料法采用 PicoGreen 等可特 41 以熒光酶 異與雙鏈 DNA 形成復合物的熒光染料 ， 標儀檢測， 根據(jù)標準曲線與供試品的熒光強度， 計算 DNA 殘留量。該方法簡便快捷， 但由于抗體藥物殘 余 DNA 質控標準較高和檢測限的原因， 熒光染色法 DNA 通常不適用于抗體藥物的 殘量控制。 3 4 重組抗體藥物的成品質控 重組抗體藥物的成品除含量、 生物學活性及必 要的理化特性檢測外， 還應該按照注射劑的要求， 進 包括鑒別試驗、 外觀、 可見 行其他常規(guī)項目的檢測， pH 值、 異物、 裝量、 水分、

43、無菌檢查、 細菌內毒素檢 查、 異常毒性檢查等， 具體測定方法參見現(xiàn)行中華 及其他相關技術文件。 人民共和國藥典 4 重組抗體藥物未來需要開展的工作 我國重組抗體藥物的質量控制技術隨著抗體藥 物研發(fā)的深入也在不斷的發(fā)展和完善 。未來抗體藥 物質控仍需進一步關注以下幾個主要方面 。 4 1 生產細胞的質量控制 目前現(xiàn)行版藥典關于細胞庫管理和檢定要求， 經多年的實踐證明可以保障重組抗體等生物技術藥 1853 中國新藥雜志 2011 年第 20 卷第 19 期 記分子的細胞替代了包被的可溶性抗原或受體 ， 通 過流式細胞儀測定陽性細胞率來檢測競爭結合的效 對難于獲 果。該方法避免了相應抗原的制備過程

44、， 得可溶性抗原的重組抗體可采用該方法進行結合活 性測定， 同時細胞表面抗原的空間結構近乎于天然 存在形式， 其測定結果應更加客觀。 3 2 2 3 BIA 法34 35 基于 SPR 的 BIA 法測定周 期短、 待測樣品消耗量少， 該方法在測定抗原抗體結 合活性時無需標記， 避免了標記對分子結構的影響， 可更加真實地反映抗原抗體的結合情況。其檢測芯 Chinese Journal of New Drugs 2011 ， 20 （ 19 ） 物生產細胞株的總體質量， 但作為逆轉錄病毒檢測 常用方法的逆轉錄酶活性測仍有待進一步完善 ， 即 需建立均一、 穩(wěn)定的 RNA 模板和逆轉錄酶活性標準

45、品， 并采用諸如定量 PCR 等方法進行酶活性定量。 4 2 重組抗體結構分析 質譜儀、 毛細管電泳儀、 新型高效液相系統(tǒng)等新 其專屬性、 檢測限、 回收率 法。如采用商用試劑盒， 等參數(shù)需經驗證通過后方可使用 。 由于重組抗體藥物劑量大， 雜交法、 熒光染色法 待檢樣品中核酸 雖然可以通過增加標準品回收率、 富集等前處理步驟， 對制品中的核酸殘量進行控制， 但由 于 方 法 的 局 限 性 仍 需 進 一 步 完 善。 而 定 量 PCR 方法在特異性、 靈敏度、 準確性方面具有獨特 的優(yōu)勢， 可比較客觀地對殘余 DNA 定量， 并且反映 片段的相對分子質量分布。但該方法仍需要對引物 設計、

46、 標準品等做進一步的優(yōu)化與規(guī)范。 同時殘余 DNA 的檢測也需要結合工藝驗證來綜合控制 。 5 結語 如何更加科學有效地對重組抗體藥物的質量進 還需要結合臨床評價及上市后的安全性監(jiān) 行控制， 測， 進一步對質控方法學、 相關標準物質開展深入研 究。本文對國內外有關重組抗體藥物的質量控制研 旨在拋磚引玉， 究進展和亟待解決的問題進行綜述 ， 引發(fā)大家對相關問題的關注和討論 。 志謝：感謝中國食品藥品檢定研究院重組技術產品室饒 春明研究員對于本文提供的相關資料及修改意見 。 參 考 文 獻 型儀器的應用， 可有效提升抗體質控中結構分析的 水平。例如國外研發(fā)單位在重組抗體理化對照品充 分研究、 鑒定

47、的基礎上， 已在重組抗體肽圖的質控 中， 將質控標準從對翻譯后修肽段的定性分析提高 為定量檢測， 而由于各種條件的制約， 目前我國重組 抗體藥物質控理化對照品的研究還不夠詳盡 ， 并且 質控標準中肽圖分析結果僅要求與對照品一致 。同 時重組抗體翻譯后修飾的糖鏈十分復雜、 并且其結 構與生物學功能相關， 因此糖基化分析十分具有挑 因此也是抗體質量控制的重點和難點。 目前 戰(zhàn)性， 雖然可以采用質譜等分析手段對唾液酸、 寡糖圖譜 并反映一定的糖基化信息， 和糖基化位點進行分析， 但目前沒有一種簡便易行的方法， 能快速地對糖鏈 的結構進行全面的分析和鑒定。 4 3 重組抗體生物學活性檢測 抗體活性檢測

48、方法因其功能各異而具有多樣 性， 通常于體外采用細胞評價模型模擬其作用機制 產生量效反應進行， 但在實際工作中， 有些活性檢測 步驟繁瑣、 影響因素多， 重復性不理想， 并 周期較長， 且有些重組抗體藥物無法找到合適的細胞株進行活 性測定， 進而采用抗體結合活性作為其功能性評價 指標。針對上述有待進一步完善的環(huán)節(jié)， 可基于對 ， 胞內信號傳導通路的了解 構建相應的轉基因細胞， 以期建立更加準確、 耐用和便捷的活性測定方法。 另一方面， 目前抗體生物學活性測定標準主要是以 相對于標準品活性的百分含量體現(xiàn)的， 即是一個相 如能夠借鑒其他生物學技術藥 對生物學活性結果， 物質控經驗， 對重組抗體藥物

49、的生物學活性單位進 行科學的賦值和定義， 并加強標準物質穩(wěn)定性的研 將可以更加客觀有效地評價重組抗體產品的有 究， 效性， 同時也便于類似抗體產品之間的比對研究 。 4 4 重組抗體殘留雜質分析 在重組抗體質控中， 需要對宿主細胞蛋白、 蛋白 1 RATHORE AS， MHATRE R Quality by design for biopharmaprinciples and case studiesM John Wiley Sons， ceuticals， 2009 ： 1 2 國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心 重組制品生產用哺乳 EB / OL 2006 10 動物細胞質量控制技術評價

50、一般原則 http： / / www cde org cn / zdyz do？ method = largePageid = 59 3 Derivation and characterization of cell substrates used for production of biotechnological / biological productsEB / OL 1997 http： / / www ich org / fileadmin / Public_Web_Site / ICH_ 07 16 Products / Guidelines / Quality / Q5D / S

51、tep4 / Q5D_Guideline pdf 4 Food and Drug Administration Center for Biologics Evaluation and Research： Bethesda Points to consider in the characterization of USA： 1987 cell lines used to produce biologicalsS MD， 5 國家藥典委員會 中華人民共和國藥典（ 三部） S 2010 年 2010 ： 15 版 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 6 國家藥典委員會 中華人民共和國藥典（ 三部） S 2

52、010 年 2010 ： 16 17 版 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 7 張巖銳， C28 細胞染色體鑒定 段麗娟， 茍凝虹， 等 重組 CHOJ 微生物學免疫學進展， 2006 ， 34 （ 4 ） ： 40 43 方法的研究 8 國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心 生物組織提取制品 和真核細胞表達制品的病毒安全性評價技術審評一般原則 EB / OL 2005 12 http： / / www cde org cn / zdyz do？ method = largePageid = 53 9 國家藥典委員會 中華人民共和國藥典（ 三部） S 2010 年 2010 ： 19 版 北京： 中

53、國醫(yī)藥科技出版社， 10 周海鈞 藥品生物檢定M 北京： 人民衛(wèi)生出版社， 2005 ： 163 172 A 殘留進行限量控制。 雖然抗體生產中主要采用 CHO 細胞和蛋白 A， 但各單位細胞株、 生產工藝均 非一致， 因此研發(fā)單位應根據(jù)各自的生產工藝制備 抗體， 并建立相應檢測方 相應的殘量控制對照品、 1854 中國新藥雜志 2011 年第 20 卷第 19 期 Chinese Journal of New Drugs 2011 ， 20 （ 19 ） 11 王軍志 生物技術藥物研究開發(fā)和質量控制M 第 2 版 2007 ： 138 140 北京： 科學出版社， 12 Quality of

54、 biotechnological products： stability testing of biotechnological / biological productsEB / OL 1995 11 30 http： / / www ich org / fileadmin / Public_Web_Site / ICH_Products / Guidelines / Quality / Q5C / Step4 / Q5C_Guideline pdf 13 陶磊， 饒春明， 高凱， 等 重組嵌合抗 CD20 IgG1 型單克隆抗 J 藥學學報， 2010 ， 45 （ 6 ） ： 752

55、755 體的結構驗證 14 HIRANO H， KOMATSU S， KAJIWARA H， et al Microsequence analysis of the Nterminally blocked proteins immobilized on polJ Electroyvinylidene difluoride membrane by western blotting phoresis， 1993 ， 14 （ 9 ） ： 839 846 15 HAMBERG A， KEMPKA M， SJDAHL J， et al Cterminal ladder sequencing of pe

56、ptides using an alternative nucleophile in carboxypeptidase Y digestsJ Anal Biochem， 2006 ， 357 （ 2 ） ： 167 172 16 PATTERSON DH， TARR GE， REGNIER FE， et al Cterminal ladder sequencing via matrixassisted laser desorption mass spectrometry coupled with carboxypeptidase Y timedependent and Anal Chem， 1

57、995 ， 67 concentrationdependent digestions J （ 21 ） ： 3971 3978 17 REHDER DS， DILLON TM， PIPES GD， et al Reversedphase liquid chromatography / mass spectrometry analysis of reduced monoclonal antibodies in pharmaceuticsJ J Chromatogr A， 2006 ， 1102 （ 1 2 ） ： 164 175 18 饒春明， 陶磊， 史新昌， 等 重組人干擾素 1b 質量肽圖分析 2007 ， 27 （ 10 ） ： 1505 及二硫鍵定 位J 藥 物 分 析 雜 志，