1、海藻酸鈉包埋法制備固定化菠蘿蛋白酶第7卷第6期生物加工過程ChineseJournalofBioprocessEngineeringVo1.7No.6NOV.2009d0i:10.3969/j.issn.17623678.2009.06.006海藻酸鈉包埋法制備固定化菠蘿蛋白酶張琛,張寬朝,章琛,繆偉(安徽農業大學生命科學學院,合肥230036)摘要:以海藻酸鈉為栽體,包埋法固定菠蘿蛋白酶,對固定化奈件進行優化,同時探討固定化菠蘿蛋白酶的部分酶學性能.結果表明:固定化菠蘿蛋白酶的質量受海藻酸鈉質量分數,固定化酶量,固定化時間以及CaCI質量分數的影響,其最佳固定化條件為:海藻酸鈉質量分數1.0

2、%,CaC1質量分數3%,固定化酶液量與海藻酸鈉體積之比1:2,固定化時間60rain,在此條件下,制備的固定化菠蘿蛋白酶的比活力為2l1.8U/g(濕質量載體),由此制得的固定化酶的最適pH為7.6,與游離酶相比,升高了0.8個pH單位,同時顯示固定化菠蘿蛋白酶能耐受較高的堿性環境,固定化酶最適溫度與游離酶相同,均為5O,固定化酶在較高溫度范圍內,仍能保持較高的相對活力.關鍵詞:海藻酸鈉;固定化;菠蘿蛋白酶中圖分類號:Q8l4文獻標志碼:A文章編號:16723678(2009)06003l一04Immobilizationofbromelainbyembeddinginsodiumalgin

3、ateZHANGChert,ZHANGKuanchao,ZHANGChen,MIAOWei(CollegeofLifeScience.AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei230036,China)Abstract:Sodiumalginatewasusedasacarrierfortheimmobilizationofbromelain.Theoptimumoperationconditionswereasfollows:theconcentrationofsodiumalginateandCaCl,solutionwere1.0%and3.0%,respecti

4、vely;theratioofenzymesolutiontosodiumalginatewas1:2;theimmobilizationtimewas60min.Undertheseconditions,theoptimumpHoftheimmobilizedenzymewasshiftedform6.8to7.6.andtheoptimumreactiontemperaturewas5O.Keywords:sodiumalginate;immobilization;bromelain菠蘿蛋白酶存在于菠蘿植株中,含有多種蛋白水解酶組分,對蛋白質及多肽具有催化水解活性,食品工業上用于啤酒澄清,

5、肉類嫩化及水解蛋白的生產等;醫藥上主要用于抗炎,消除水腫,燒傷后脫痂等'畜牧業中,菠蘿蛋白酶可作為一種新型安全獸藥'.但菠蘿蛋白酶作為生物活性物質,易受有關因素的影響而失活.固定化酶與游離酶相比,具有熱穩定性高,保存穩定性好,抵抗性強,不易水解以及對變性劑的耐受性好等特性,因而固定化技術成為生物酶得到廣泛而有效利用的重要手段.制備固定化酶的方法主要有吸附,包埋,共價鍵結合和交聯法等,其中包埋法不需要化學修飾酶蛋白的氨基酸殘基,具有反應條件溫和,很少改變酶分子結構,酶活力損失小等優點一.固定化酶常用的包埋材料有很多,其中海藻酸鈉最為常見,二價金屬離子如Ca"與可溶性海藻

6、酸鈉反應生成海藻酸鈣微凝膠,無毒,安全,有良好的生物相溶性,可以在溫和條件下實現對酶的固定,有助于保持酶的生物活性.此外海藻酸鈉具有價格低收稿日期:20090330基金項目:國家自然科學基金資助項目(30570004);安徽農業大學校綜合性實驗項目作者簡介:張琛(1968一),男,安徽淮南人.講師,博上研究生,研究方向:生物化學與酶工程,E-mail:swzzcO1163.COIll32生物加工過程第7卷廉,材料易得等特點,因而受到廣泛重視,已應用于藥物緩釋與食品,生物工程等領域.本文利用海藻酸鈉為載體對菠蘿蛋白酶進行固定化,分析固定化條件對菠蘿蛋白酶活性的影響,同時對固定化酶的酶學性質進行初

7、步探討,為菠蘿蛋白酶的固定化制備提供參考依據.1材料與方法1.1主要材料與試劑菠蘿蛋白酶參考文獻9實驗室自制;酪蛋白(進口分裝),海藻酸鈉,化學純;三氯乙酸等試劑為國產分析純.1.2主要儀器與設備紫外可見光分光光度計,南京第四分析儀器有限公司;HH一2數顯恒溫水浴鍋,常州國華電器有限公司;FA2024A電子天平,上海精密科學儀器有限公司;pH213酸度計,上海精天電子儀器廠;離心沉淀器,長沙平凡儀器儀表有限公司.1.3實驗方法1.3.1固定化菠蘿蛋白酶的制備參考文獻10制備固定化菠蘿蛋白酶.1.3.2菠蘿蛋白酶的活力測定參考文獻1112進行菠蘿蛋白酶的活力測定.酶活力單位定義:一個酶活力單位是

8、指在一定實驗條件下(pH7.0,35oC時,一定底物濃度,反應體積,反應10rain)水解酪蛋白產生1tzg酪氨酸時所需要的酶量,單位U/g.固定化酶的相對活力是指在同組試驗中以活性最高的為100,其余的固定化酶活力與之相比,以百分數表示.2結果與討論2.1固定化條件對固定化酶活力的影響2.1.1海藻酸鈉質量分數對固定化酶活力的影響將一定量酶液與不同質量分數的海藻酸鈉溶液混合,測定固定化酶的活性.結果如圖1所示.由圖1可知,在海藻酸鈉質量分數為1.0%時,固定化酶活力最大.當海藻酸鈉質量分數過大時,其黏度很大,難以擠成球狀,影響凝膠成型,同時凝膠的孔徑也小,影響酶與底物的結合.反之海藻酸鈉質量

9、分數太小,凝膠的孔徑較大,固定化酶容易流失,也會影響酶活.因此,合適質量分數的海藻酸鈉易形成機械強度適宜的凝膠,同時底物和產物10090!g80鰉70正6O500.51.O1.52.O2.53.0(海藻酸鈉)/%圖1海藻酸鈉質量分數對固定化酶活性的影響Fig.1Effectsofsodiumalginateconcentrationonactivityofimmobilizedenzyme易于從凝膠微孑L擴散通過,酶促反應速度較快,所以選擇海藻酸鈉質量分數1.0%為宜.2.1.2酶量對固定化酶活力的影響用于固定化的酶量直接關系到固定化酶的活力,酶的加入量亦有一最佳值,將酶液量與質量分數為1%海

10、藻酸鈉溶液按體積比1:1,1:2,1:3,1:4進行固定,測定固定化酶的活力,結果如圖2所示.lo09O80星7o60501:21:31:4酶液):海藻酸鈉)圖2固定化酶量對固定化酶活力的影響Fig.2Effectsofdifferentenzymeamountsonactivityofimmobilizedenzyme由圖2可知,當酶液量與海藻酸鈉溶液體積比大于1:2時,固定化酶的活性下降,小于1:2時而略有降低,綜合考慮,選擇酶液量與海藻酸鈉溶液的體積比為1:2為宜.2.1.3CaC1質量分數對固定化酶活力的影響CaCI,的質量分數對形成凝膠的機械強度有重要影響.CaC1:質量分數太大,過

11、多的Ca¨布滿ca凝膠表面,由于Ca會與酶作用,從而降低酶活性,若太少又導致凝膠強度太小,包埋不完全,包埋在內部的部分酶會流失.將酶液與1%海藻酸鈉溶液以1:2比例混合固定60min,測定固定化酶活力.結果如圖3所示.由圖3可知,CaC1質量分數為3%時,固定化酶活性達到最佳.第6期張琛等:海藻酸鈉包埋法制備固定化菠蘿蛋白酶圖3CaC!:質量分數對固定化酶活性的影響Fig.3EffectsofCaC12concentrationonactivityofimmobilizedenzyme2.1.4固定化時間對固定化酶活力的影響固定化時間是海藻酸鈉與固定化酶的混合液滴落到CaC1溶液中的

12、反應時問.以上述條件,取酶液與海藻酸鈉溶液混勻,滴入3%的CaC1,溶液中,分別固定30,4O,5O,60,70,80,90min,測定固定化酶活力,結果如圖4所示.l0o90衄踺暈80703040506070SO90timii1圖4固定化時間對固定化酶活性的影響Fig.4Effectsofimmobilizedtimeonactivityofimmobilizedenzyme由圖4可知:開始固定化時,固定化酶的活性呈升高趨勢,到60min固定化酶活達到最大.隨著固定化時間延長,固定化酶活性降低,這可能是因為隨著固定化時間延長,交聯程度高,高分子結構致密,底物擴散阻力增加.綜合考慮上述不同因素

13、對固定化酶活性影響,在此優化條件下,制備的固定化菠蘿蛋白酶活性為211.8U/g(濕質量載體)2.2固定化酶的酶學性質2.2.1溫度對固定化酶和游離酶活力的影響在上述最佳固定化條件下,制備固定化酶,分別于30,35,40,45,50,55,60,65cc下測定固定化酶和游離酶活性,并計算相對活力,結果如圖5所示.蜒避-,!x1()0908O7O603035404550556065:圖5溫度對固定化酶和游離酶活力的影響Fig.5Effectsoftemperatureonactivityofimmobilizedenzymeandliquidenzyme由圖5可知,與游離酶相比,固定化后酶的最適

14、反應溫度為50cc,最適反應溫度沒有改變,但固定化后酶在較高溫度范圍內,仍保持較高的相對活力,分析原因可能是固定化載體穩定¨r酶的空間結構,使酶對熱的穩定性有所提高.2.2.2pH對固定化酶和游離酶活力的影響上述其他條件不變,反應溫度為50qC,在不同pH的磷酸緩沖溶液中測定固定化酶和溶液酶活力,結果如圖6所示.由圖6可知,隨著pH值的提高,固定化酶活性逐漸上升,其最適pH為7.6,而溶液酶的最適pH為6.8,固定化酶在pH7.28.0范圍內,仍保持較高的相對酶活,這顯示固定化酶比游離酶較耐堿,相比游離酶有更寬泛的適應性:可能原因是由于固定化后,載體對酶空間結構產生影響,帶負電荷的載

15、體制備的固定化酶,最適pH向堿性偏移圖6pH對固定化酶和游離酶活力的影響Fig.6EffectsofpHonactivityofimmobilizedenzymeandliquidenzyme3結論利用海藻酸鈉作為載體制備的固定化菠蘿蛋白酶的活力受海藻酸鈉質量分數,固定化酶量,固舳634生物加工過程第7卷定化時間以及CaC1質量分數等因素的影響,其最佳固定化條件:海藻酸鈉質量分數1.0%,固定化酶液量與海藻酸鈉體積之比為1:2,固定化時間為60rain,CaC1,質量分數為3.0%,在此條件下,制備的固定化菠蘿蛋白酶的比活力為211.8U/g(濕質量載體).固定化后的菠蘿蛋白酶最適溫度50,沒

16、有發生改變,但固定化酶在較高溫度范圍內,仍能保持較高的相對活力;最適pH為7.6,與游離酶相比,升高了0.8個pH單位,同時顯示固定化菠蘿蛋白酶能耐受較高的堿性環境.本文僅對菠蘿蛋白酶在海藻酸鈉中固定化條件進行了初步探討,分析了固定化后酶的某些特性,有關固定化菠蘿蛋白酶應用條件及相關因素還有待進一步研究.參考文獻:1章佩芬,郭勇,羅煥敏.菠蘿蛋白酶的研究與應用進展J.華西藥學雜志,2002,17(2):128129.ZhangPeifen,GuoYong,LuoHuanmin.ProgressinresearchandapplicationofbromelainJ.WestChinaJourn

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