1、殼寡糖產業化可行性報告國家“九五”攻關科技成果（ 96- -C C 03- - 01- - 01 ） 殼寡糖產業化可行性報告 中國科學院大連化學物理研究所 天然產物與糖工程課題組 20_1 年 7 月 殼寡糖產業化可行性報告 第一部分：項目背景及進展 該課題是國家科技部“九五”攻關項目，于 20_ 年 8 月通過由中國科學院組織的專家鑒定，該項工藝是首次利用酶工程、生化反應分離耦合技術和納米濾膜濃縮和純化技術制備低聚氨基葡萄糖，經查新，國內外未見報道。首次開發出低聚氨基葡萄糖保健食品和生物農藥，同時研制開發的奧利奇善膠囊獲得衛生部保健食品證書，中科 6 號（好普）生物農藥獲農業部農藥檢定所新農

2、藥登記證書。并率先實現了低聚氨基葡萄糖生物農藥的產業化及在植物病害防治方面的應用，達到了國際領先水平。（意見詳見成果鑒定證書）。（一）項目的意義和必要性 由于我國保護知識產權法律的制定與實施，以及加入 WTO 日趨臨近，研制創新藥物是十分迫切的任務，需要下大力氣研究開發具有我國自主知識產權的新型藥物。開發治療重大疾病的藥物，關鍵在于發現具有生物活性的化合物或優秀的先導化合物，然后進行結構改造和優化，選擇適宜的加工技術和產業化工程，進而開發出創新藥物。我國具有豐富的生物資和天然藥物寶庫，從生物資中尋找新型先導化合物和創制新藥，利用生物加工技術開發和利用我國的生物資，從而促進生物來藥物生產的高技術

3、化。繼基因工程、蛋白質工程之后，糖工程已成為最引人注目的生物技術新領域。近年來的研究表明，無論是在基本的生命過程中，如受精、發生、發育、分化、神經系統、免疫系統恒態維持方面，還是在疾病的發生、發展中，如炎癥及自身免疫疾病、老化、癌細胞異常增生及轉移、病原菌感染等過程中，都涉及寡糖鏈的參與。以寡糖片段干擾疾病的發生、發展以及致病菌的侵染，將是從病理上的根治與預防。因此，通過多糖降解、化學合成、轉化及分子修飾等手段尋找具有生理活性的天然寡糖藥物已成為國際上寡糖藥物開發的熱點，利用該技術開發寡糖類新型藥物對人類健康意義重大。地球上兩大生物群體，即細胞壁中具有甲殼質的生物和具有纖維素的生物,具有甲殼質

4、的生物進化為菌類、節足動物，具有纖維素的生物則進化為植物和脊椎動物。兩大生物群體彼此互相攻擊、防衛，又相互利用、依存，以維持自己的生命，形成食物鏈。在一個多世紀前就發現了甲殼質，但它的優異功能只是在近 40 年，特別是近十年才被人們逐步認識，已形成了一門新興學科-甲殼質化學。幾丁質又名甲殼質，存在于昆蟲、甲殼類動物外骨骼和真菌細胞壁及一些綠藻中，它是由N-乙酰氨基葡萄糖聚合而成的多糖。幾丁質在自然界中每年生成量約有 100 億噸，其中 10來于海洋，產量僅次于與之結構相似的纖維素，是自然界第二大類的有機物質。幾丁質和殼聚糖的研究利用已引起國外許多國家政府、企業及學者的重視。除了糖、蛋白質、脂肪

5、、維生素與礦物質外，甲殼質被譽為人體所必需的第六生命要素。甲殼素經過胃酸、人體溶菌酶（Lyozyme)、甲殼酶（chitinase）、脫乙酰酶（deacylase）、殼聚糖酶（chitosanase）等作用，經轉化、降解成低分子物質，才能被人體吸收。其主要的活性分子-殼寡糖和幾丁寡糖在抑制癌細胞、抑制癌細胞轉移、抑制癌毒素的作用中扮演著重要的角色。而殼寡糖又是一種先導化合物，對其進行的化學修飾又可形成多種藥物活性的新藥如低分子肝素等。此外殼寡糖具有抗炎止痛，促進傷口愈合功能；調節腸道菌群等多種功效。寡糖抗癌、抗炎藥物已成為國際上研究開發的熱點。也將帶來一場商業競爭大戰。中國進入 WTO后，該類

6、藥物也將會在幾年時間內大量涌入我國。在農業生產中，對多種蔬菜、水果的病害，特別是病毒病防效顯著，已獲得大量的田間應用實驗結果，同時殼寡糖還具有促生長、增產及保鮮功能。寡糖生物農藥的開發應用中國目前暫處領先位置；在畜牧養殖業上應用殼寡糖，可提高動物的抗病能力，減少抗生素的使用，是新型的一類寡糖工程產品，國際上已開始應用于飼料及餌料添加劑中，目前國外的寡糖飼料添加劑剛剛進入中國。殼寡糖及幾丁寡糖的制備及其糖生物學研究已成為目前國家上甲殼素研究開發的熱點。中國具有豐富的殼寡糖生產的原料自然資，是甲殼質類產品的大國，目前每年生產量約為 20_-3000 噸。而該類產品多是將蝦蟹殼經強酸、強堿處理除蛋白

7、、脫鈣后及脫乙酰化處理后得到。形成一定程度的環境污染。而我國目前甲殼素的深加工產品很少，多數是以原料的形式出口，經過國外深加工后返銷中國，因此急需發展具有我國自主知識產權的甲殼素深加工技術，加速殼寡糖開發應用研究。對人類健康、經濟和社會發展以及環境的改善具有重要意義。（二）國內外研究進展及趨勢 近 10 年來生物技術制藥越來越被人們所重視，醫藥生物技術產品產業化進程突飛猛進。采用生物轉化等手段加工天然藥物，從天然生物資中發現先導化合物和新藥物是總趨勢，也是我國中藥現代化、規模化、標準化的迫切任務。寡糖藥物是糖工程發展的重點之一。1990 年 11 月第一次在人體中確證了寡糖 SLe_ 的生理功

8、能，這一發現引發了一場制備抗炎藥物的大競賽，目前正在進行臨床試驗的寡糖藥物有靶向肺炎、腹瀉致病菌的 NE1530 和 NE1340，靶向幽門螺旋桿菌的 NE0080，抗 HIV-I 病毒的寡糖衍生物以及抗寡糖腫瘤疫苗。最近通過大量篩選，在上千種化學合成和天然來的化合物中篩選到幾種 SLe_ 糖鏈類似物，發現其中效果最好的是甘草素，可用于封閉血管內皮細胞表面E-selectin，從而達到抗炎及抗癌細胞轉移的目的。甘草素來于中藥甘草，盡管中國人早就知道甘草有抗炎效果，但并不清楚其治療機理。這一發現充分證明：寡糖藥物的研究開發有助于闡明中藥治病的某些機制、為中藥實現現代化作出貢獻。寡糖藥物的開發在西

9、方發達國家受到高度重視。目前大多數寡糖藥物正處于臨床前或臨床試驗階段。日本則于 1991 年實施了一項投資數百億日元、為期 15 年的“糖工程前沿計劃”，開展糖生物學基礎與應用研究。歐盟 94 年啟動“歐洲糖研究開發網絡”，目的是協調歐洲各國的糖研究與開發，以強化歐洲在糖的基礎研究及將研究成果轉化為商品方面與美國和日本競爭的能力。這些研究計劃的顯著特點表現為在內容上基礎研究和應用研究并重、方法學研究和有重要意義的目標物合成的研究同時進行。在甲殼素研究方面日本出上億日圓巨資由 13 所大學聯合研究開發，現已開發多種殼聚糖產品，部分已進入中國市場，對寡糖的制備及其新藥的研究開發一直在進行之中。歐美

10、近年也加快了甲殼素的研究開發進度。甲殼素國際學術會議頻繁舉行。最新研究表明甲殼素/殼聚糖的寡糖具有抗腫瘤和抑制腫瘤轉移的生理功能以及增強機體免疫力的作用，機理主要是提高巨噬細胞活性，能將 ALK 細胞功能提高 3 倍，提高 NK 細胞的活性 4.5 倍，并可附著在血管細胞表面，達到抑制癌細胞轉移。聚合度為 47 的幾丁寡糖對BALB/c 白鼠的腹膜滲出液的細胞具有強烈反應，幾丁六糖和殼六糖對 Sarcima-180、MM-46、Meth-A 等瘤細胞的生長有完全的抑制效果；當 Lewis 肺癌靜脈注入到小白鼠體中，幾丁六糖具有抑制癌細胞轉移效果。六糖使攜帶腫瘤的小白鼠對綠膿桿菌、白假絲酵母等感

11、染有防治作用。幾丁六糖達到 100mg/kg 體重時無毒性、無變異性和無熱原性，并且增加活體巨噬細胞釋放白細胞素，因此對細胞分裂具有調節作用。而對于其進一步的作用機理目前國內外尚不清楚。殼寡糖制備技術國際上研究進展 l 化學法 1957 年， Horowitz 等用濃鹽酸部分水解殼聚糖，用 Dowe_-50 陽離子交換柱色譜精制得到單糖到五糖，但是單糖含量很高，寡糖低，并且需要大量的離子交換樹脂。水解過程中，殼聚糖比幾丁質易溶于稀酸，使殼聚糖的酸水解較為困難，要強化水解條件。最近有報道用離子交換色譜，鹽酸濃度梯度洗脫寡糖。還有用雙氧水或過硼酸鈉降解殼聚糖制備殼寡糖，但是制備較繁瑣，得到主要是四

12、糖以下的產品。l 專一性酶降解法 殼聚糖酶廣泛分布于細菌和真菌中，其主要作用于b-1,4 葡萄糖胺糖苷鍵。從 Bacillus sp.No.7-M 來的殼聚糖酶只切斷 GLCN-GLCN,而從 Bacillus pumilus BN-262 來的殼聚糖酶切斷GLCNAC-GLCN 及 GLCN-GLCN，從 Streptomyces griseus HUT 6037 來的殼聚糖酶切斷 GLCN-GLCNAC 和 GLCN-GLCN。殼聚糖酶降解部分脫乙酰度的殼聚糖都得到雜寡糖。Bacillus R-4 生產的殼聚糖酶降解脫乙酰度為 80及 100的殼聚糖，發現對脫乙酰度為100的殼聚糖，6 小

13、時可生成二到六糖，48 小時得到主要是二到四糖，并且得到較高的收率。Izumi 等用 Bacillus sp.No.7-M 生產的殼聚糖酶，降解部分乙酰化的殼聚糖，后用離子交換樹脂分離，獲得二到五糖，其中三、四糖含量非常高，收率高達為 60。如用精制的殼聚糖酶可以得到少量的六、七糖。Sei-ichi Aiba 利用溶菌酶降解部分乙酰化的殼聚糖，得到主要是四糖以下的產物。聚合度高的寡糖難以獲得。l 非專一性酶降解法 從纖維素與殼聚糖的結構相似得到啟示，研究發現纖維素酶可以降解殼聚糖。迄今為止，已發現有 37 種各類水解酶如蛋白酶、脂肪酶、糖苷酶等對殼聚糖都有降解效果。從作用效果及酶的來分析p ，

14、如此廣泛的酶似乎不存在共同的催化基團，其具體的降解機制尚未能得到解釋。從降解情況可以得到酶降解過程中的幾個共同特點：水解初期，溶液粘度迅速下降，說明酶以內切方式作用；反應不遵循米氏方程，無論提高酶濃度還是底物濃度都可能提高反應速度。由于非專一性酶降解速度快，這也是生產寡糖的一條途徑。幾丁質與殼聚糖的寡糖具有多種生理功能，將在食品、化妝品、抗癌藥物、生物農藥、診斷試劑等方面得到廣泛的應用。酶法制備寡糖優于化學法，因為化學反應條件十分苛刻，不易控制，且后處理繁瑣。酶法降解的幾種方法各有所長，對這幾種方法進行深入的研究，將會實現大規模生產幾丁質和殼聚糖的寡糖的目的。我國在此方面也取得一定的研究成果，

15、在科技部“九五”攻關及 863 等項目的支持下，在國際上中國科學院大連化學物理研究所首次報道并采用酶反應分離耦合技術制備殼寡糖，研制開發成功第一個殼寡糖生物農藥，同時成功地研制出具有抗癌活性的殼寡糖保健食品-“奧利奇善膠囊”。（三）市場需求 醫藥生物技術產品發展迅速，據統計，1998 年美國已有 58 種產品被 FDA 批準上市。1997年全球生物技術醫藥產品銷售額只有 100 億美元左右，預計到了 20_ 年，生物技術醫藥產品銷售額可達到 250500 億美元，且呈明顯增長趨勢。美國 Plan A 咨詢公司 1992 年提交了“Strategies in Carbohydrate Drugs

16、 1992-20_”的諮詢報告，指出在癌癥、自身免疫疾病、感染和心血管病的治療診斷中糖藥物將會占有很大比例，預計到 20_ 年僅在美國就會有 37 億美元的寡糖藥物市場。寡糖藥物展現了無限商機。我國如能及時組織有關研究單位開展系統的寡糖藥物的研究開發，力爭在這一領域與國際發展同步，必將會使我們在治療癌癥、自身免疫疾病、感染和心血管病等影響人類健康重大疾病的寡糖藥物研究方面形成具有自主知識產權的成果，形成巨大的市場。我國是人口大國，也是醫藥消費的大市場，經濟的發展，人口趨向老齡化，都將促進用藥的增長。預計在未來的 15 年內，我國的醫藥市場仍將保持平均年增幅約 11-12的趨勢，僅20_ 年的醫

17、藥市場就將達到 2250 億元人民幣的規模。目前，我國抗感染藥產量占全部醫藥品總產量的 15左右，其中抗生素占抗感染藥的 60左右。在中國肝細胞癌（HCC）是危害人民健康的第二大腫瘤，年發病人口 14 萬，惡性程度高，發展快，堪稱“癌中之王”。而歐美國家由于原發性 HCC 發病稀少而極少研究之。再者，由于HCC 的發生與 B 型及 C 型肝炎病毒感染密切相關，我國存在大量 HCC 高危人群，急待發展針對HCC 的預防措施；而且 HCC 經無論何種治療后復發率都甚高，即使最理想的手術切除后的小肝癌的復發率也有 4050，大肝癌則高達 80。復發與轉移成為 HCC 患者預后不良的主要原因。因此，利用糖生物學及糖工程研究的新進展，研制開發針對肝癌的新型殼寡糖抗癌新藥不僅具有重要的學術理論價值，而且具有重大的社會意義及巨大的市場前景。（四）前期相關研究工作基礎 在科技部“九五”攻關項目“殼聚糖生物降解制備低聚氨基葡萄糖”及中科院重點項目的支持下，進行并完成以下工作：主要工作【摘要】：p ：本項目以甲殼素為原料，研究酶法降解制備殼寡糖的方法，通過對專一性和非專一性降解酶的篩選，確定以殼聚糖酶或 6036 酶為降解酶；探索了以球孢白僵菌發酵酶液代替6036 酶的可