1、食品與藥品Food and Drug年第卷第期綜述核磁共振波譜法在多糖結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用劉玉紅，王鳳山（山東大學(xué)藥學(xué)院生化與生物技術(shù)藥物研究所，山東山東摘濟(jì)南；山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南）要：多糖由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜使解析結(jié)構(gòu)非常繁瑣和困難，使對各種多糖的深入研究受限。核磁共振波譜法（）是解析物質(zhì)結(jié)構(gòu)最有效的手段，近年該技術(shù)的發(fā)展也很迅速。本文綜述了一維核磁共振（）和二維核磁共振波譜法（，包括，與）在多糖結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用。這些技術(shù)可以提供如多糖的單糖組成、單糖殘基間的順序、單糖殘基在糖苷鍵中的位置、環(huán)狀結(jié)構(gòu)的類型和糖苷鍵的構(gòu)型等許多信息，成為分析多糖結(jié)構(gòu)不可缺少的工具。關(guān)鍵詞：核磁共振波譜法；多糖；結(jié)構(gòu)

2、分析中圖分類號：文獻(xiàn)標(biāo)識碼：文章編號：（），（，；，）：，（）（）（，），：；多糖是生物體內(nèi)普遍存在的一類生物大分子，的位置，環(huán)狀結(jié)構(gòu)的類型和糖苷鍵的構(gòu)型。而組成糖結(jié)合物在細(xì)胞識別、細(xì)胞間物質(zhì)運輸和調(diào)節(jié)免疫功能等方面具有重要的功能。目前已從多種生物體中提取了多種活性多糖，發(fā)現(xiàn)它具有免疫調(diào)節(jié)、抗多糖的研究引起了越來越多的重視，。包括單糖殘基的種類和順序，多糖殘基在糖苷鍵中收稿日期：作者簡介：劉玉紅（），女，山東菏澤人，博士研究生，研究方向為天然藥物：多糖的單糖品種繁多，單糖的連接順序、連接位置的不同以及是否存在側(cè)鏈?zhǔn)苟嗵墙Y(jié)構(gòu)更具復(fù)雜性，其結(jié)構(gòu)鑒定也更困難。目前常用的多糖結(jié)構(gòu)分析方法大類，其中物理

3、分析法包括核磁共振波譜現(xiàn)將近年來核磁共振波譜在多糖結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用腫瘤、抗病毒、降血糖、降血脂等作用。因此，法主要分為化學(xué)分析法、生物學(xué)分析法和物理分析結(jié)構(gòu)是多糖活性的基礎(chǔ)，多糖一級結(jié)構(gòu)的研究（）、紅外光譜、質(zhì)譜、射線衍射光譜等。進(jìn)展作一綜述。一維核磁共振食品與藥品Food and Drug年第卷第期化位移規(guī)則，即糖上羥基被其它基團(tuán)取代后其相連羥基碳的化學(xué)位移向低場移動，確定多糖殘基中的取代位置和分枝點的位置。等設(shè)計的計算機(jī)程序，用于測定具有有序重復(fù)單元的多糖結(jié)構(gòu)。該程序利用多糖的及單糖和甲基化分析的信息，基于重復(fù)單元中單糖的特性和不同連接位置的差異，構(gòu)建學(xué)位移數(shù)據(jù)，模擬出可供選擇的結(jié)構(gòu)波譜，

4、從中篩選出與所測未知多糖波譜最一致的結(jié)構(gòu)。該程序驗展的擴(kuò)展版本，利用及的信息，可以測定具有分枝的復(fù)雜多糖的結(jié)構(gòu)。驗證了個已知多糖，有個多糖的結(jié)構(gòu)被正確推導(dǎo)出，第個多糖測定出與相一致的有個，其中有一個是正確的結(jié)構(gòu)。該程序在后來的多糖結(jié)構(gòu)分析中也得到了應(yīng)用。二維核磁共振（）是有兩個時間變量，經(jīng)兩次傅里葉變換得到兩個獨立的頻率變量的譜圖。多糖中相同原子的化學(xué)環(huán)境差別不大，信號重疊嚴(yán)重，利用技術(shù)，可以使難以辨認(rèn)的信號得到確認(rèn)，并可得到多糖分子的構(gòu)型及構(gòu)象方面的信息。（，相關(guān)能譜法）包括，和，。，提供的是分子中氫原子與氫原子間通過化學(xué)鍵的偶合關(guān)系，包括質(zhì)子間孿生（）、鄰位（）或遠(yuǎn)程如烯丙位和形（）的偶合

5、，一般沒有質(zhì)子間的空間偶合關(guān)系。偶合常數(shù)越大，偶合峰越強(qiáng)。通過糖上質(zhì)子間的偶合關(guān)系，可從容易辨認(rèn)的質(zhì)子（如異頭質(zhì)子或甲基質(zhì)子）開始，尋找糖上其它碳位的質(zhì)子。來源于（）的（）葡聚糖，由，歸屬了每個質(zhì)子信號。等從每個質(zhì)子的信號得到了確認(rèn)。，是和核之間的位移相關(guān)譜，它將直接相連的和核關(guān)聯(lián)起來。揭示出哪個原子連接于哪個原子，一個原子上連接幾個原子。寬的特點，一些在中十分擁擠區(qū)域中的質(zhì)子信號在，中隨化學(xué)位移分布極寬的檢測組成有機(jī)化合物分子的原子核性質(zhì)及其與周圍化學(xué)環(huán)境的相互作用，一維核磁共振氫譜（）和一維核磁共振碳譜（）可為多糖的結(jié)構(gòu)分析提供有用的信息。多糖上的羥基信號峰較寬，化學(xué)位移值（）出所有可能的

6、排序。借助從二糖獲得的化可變，干擾其它氫信號，所以常通過重水交換除去。糖環(huán)碳上大部分質(zhì)子的化學(xué)位移由于受羥基的解析困難。但異頭氫質(zhì)子的化學(xué)位移處于較低場，在，一般情況下，此區(qū)域內(nèi)有幾個質(zhì)子信號，表示有幾種單糖種類；型吡喃糖質(zhì)子化學(xué)位移大于，型吡喃糖質(zhì)子化學(xué)位移小于，借此可以判斷糖環(huán)的構(gòu)型。如等從猴頭菇中得到一雜多糖，中有個異頭氫信號，、和，提示由種單糖組成，結(jié)合化學(xué)分析和文獻(xiàn)，分別為葡萄糖（構(gòu)型）、半乳糖（構(gòu)型）和鼠李糖（構(gòu)型）。糖環(huán)的構(gòu)型也可由異頭質(zhì)子與鄰位質(zhì)子的偶合常數(shù)（）來推斷，異頭質(zhì)子與鄰位質(zhì)子處于垂直鍵平伏鍵或平伏鍵平伏鍵方向時，為，處于垂直鍵垂直鍵方向時，為。如從真菌的子實體中得到

7、的葡聚糖，中異頭質(zhì)子與鄰位質(zhì)子的為，表明其葡萄糖殘基均為構(gòu)型。解析圖譜時一般先找出容易辨認(rèn)的質(zhì)子信號，如異頭質(zhì)子，再通過相同偶合常數(shù)的信號來確定其鄰位質(zhì)子。屏蔽作用而位于范圍內(nèi)，信號重疊嚴(yán)重，證了個已知多糖，均得到了正確的結(jié)構(gòu)。后來發(fā)的化學(xué)位移范圍較廣，達(dá)，具有較好的分辨率，并且許多文獻(xiàn)中有單糖、寡糖和多糖的碳譜數(shù)據(jù)，可用于對比確定各種碳的化學(xué)位移。和一樣，糖的異頭碳位表示有幾種單糖組成。需要注意的是，同一種單糖在多糖中的位置不同，可能會導(dǎo)致異頭碳不同的化學(xué)位移，一般比較接近，幾乎重疊。取代基不同的空間排列對化學(xué)位移有較大的影響，異頭碳上取據(jù)此可以判斷糖環(huán)的構(gòu)型，如葡萄糖，型，型。另可根據(jù)苷于

8、較低場，此范圍內(nèi)有幾個信號，中得到一個復(fù)雜的多糖，采用二維，使代基為垂直鍵比為平伏鍵的化學(xué)位移處于較高場，由于信號具有比信號化學(xué)位移散布食品與藥品Food and Drug年第卷第期信號而散開，大大簡化了信號的解析。（，總?cè)绻己铣?shù)較大，其信息會象接力賽一樣沿著碳鏈傳遞，中止于偶合常數(shù)小的部位。如葡萄糖型殘基中的質(zhì)子都是反式垂直鍵，相鄰質(zhì)子間偶合常數(shù)較大，為，在中異頭質(zhì)子信號不僅顯示與位質(zhì)子間的直接偶合相關(guān)峰，還顯示出與，位質(zhì)子間的接力相關(guān)峰；半乳糖型殘基的位質(zhì)子為平伏鍵，與位和位質(zhì)子間的偶合常數(shù)較小，在中異頭質(zhì)子信號除顯示與位質(zhì)子直接偶合相關(guān)峰外，只顯示出與，位質(zhì)子根據(jù)的特征可以判斷糖殘基

9、的類型。實驗結(jié)合能夠克服質(zhì)子信號重疊無法解析的困難，只要從該偶合鏈中選擇一個分辨良好、不與其它信號重疊的信號作為解析起點，便可以鑒定屬于該偶合鏈的所有氫信號。其單糖組成從圖譜特征中得到證實，并由其確定了各質(zhì)子的化學(xué)位移值，其中單糖殘基為半乳糖，（）顯示與（），（），（）的相關(guān)；單糖殘基（）、（）、（）、（）的相關(guān)；單糖殘基為甘露糖，（）只顯示與（）的偶合相關(guān)；單糖殘基為葡萄糖醛酸，（）顯示與的相關(guān)。的脂多糖經(jīng)緩和酸水，的基礎(chǔ)上，從其和譜中鑒定了一個半乳糖和兩個乙酰氨基葡萄糖的自旋系統(tǒng)，并從偶合常數(shù)，判斷出單糖的構(gòu)型。等從中得到的多糖，通過和實驗證實了葡萄糖殘基的存在，確定了其構(gòu)氫信號重疊嚴(yán)重的

10、多糖分子非常有用。與分子內(nèi)質(zhì)子與質(zhì)子間空間相互接近會產(chǎn)生核交叉馳豫現(xiàn)象，稱作效應(yīng)（，核歐沃豪斯效應(yīng)）。，（）揭示的就是這種質(zhì)子與質(zhì)子間在空間的相互接近關(guān)系，而非通過鍵的偶合。如葡萄糖的質(zhì)子都是反式垂直鍵，鄰位質(zhì)子關(guān)峰，而間位質(zhì)子由于空間距離接近，會有相關(guān)峰出現(xiàn)。根據(jù)這些譜學(xué)特征，結(jié)合其它二維譜，可以確認(rèn)不同的單糖殘基。多糖中相連的兩單糖殘基間，異頭質(zhì)子與另一單糖殘基相連位質(zhì)子間由于空間接近，會產(chǎn)生效應(yīng)，在中出現(xiàn)相關(guān)峰，可以推斷單糖殘基間的連接順序和連接位置，。等從中得到的多糖，單糖殘基內(nèi)（，）和（，）強(qiáng)的效應(yīng)證實了葡萄糖殘基的存在，（，）和（，）相關(guān)峰的出現(xiàn)為，糖苷鍵的特征。等從食用蘑菇的子實

11、體中得到兩個多糖和，通過實驗確定了單糖殘基間的連接順序。（的縮寫，是在自旋鎖定條件下測定的，之間的相關(guān)。對于復(fù)雜的天然產(chǎn)物，利用測定，相關(guān)信號往往很少，不利于結(jié)構(gòu)解析，用則可得到改善，不會出現(xiàn)相關(guān)峰強(qiáng)度為零相關(guān)信號。中得到的多糖，其揭示了各個殘基間的相關(guān)，在；，在；，在；，在；單糖殘基間的連接順序和連接位置。，與（，異核多量子相干），把核和與其直接相連的核關(guān)聯(lián)起來，檢測，之間的相，異核單量子相干）與比較，只是技術(shù)不同，所得到的信息與相同，檢測，之間的相關(guān)關(guān)系。通過或，可以找出與異頭碳質(zhì)子相連的碳的信號及糖基上每個質(zhì)子所連接的碳的信號。由相關(guān)能譜法）是分子內(nèi)氫偶合鏈的接力相干信息，處于糖環(huán)不同的

12、方向，在中不會出現(xiàn)相間的接力相關(guān)峰，信號的傳遞在位中止。因此，強(qiáng)的效應(yīng)表明它是構(gòu)型，而（，）如從中得到的一個雜多糖，）是旋轉(zhuǎn)坐標(biāo)系（）中為葡萄糖，（）顯示與（）、的情況，可以得到更多的（）、（）、（），在；解后，分離到一個多糖，建立在偶合常數(shù)，、，、，在，證實了重復(fù)單元中型。因此，對于解析有許多重復(fù)結(jié)構(gòu)單元、關(guān)關(guān)系。（食品與藥品Food and Drug年第卷第期脂多糖溫和酸降解得到的多糖，其圖譜揭示了直接相連，之間的相關(guān)，處的信號分別與，的信號有偶合關(guān)系，提示為兩個異頭碳的重疊峰，結(jié)合甲基化分析和其它二維譜，使得每個、的信號得到歸屬。（，即異核多鍵相關(guān)），把核和遠(yuǎn)程偶合的核關(guān)聯(lián)起來，檢測相隔

13、鍵或鍵的，之間的或相關(guān)關(guān)系。與普通的，的區(qū)別是，、和是通過豐度較高的檢測的，大大提高了方法的檢測靈敏度。通過，可以獲得跨越糖苷鍵的遠(yuǎn)程，相關(guān)信息，即相連的兩單糖殘基間，異頭質(zhì)子與另一單糖殘基相連位碳的偶合關(guān)系，從而推斷單糖殘基間的連接順序和連接位置。如從菌絲體中得到一巖藻半乳糖，其不僅顯示出每個單糖殘基內(nèi)（、）與、相隔鍵、鍵的偶合相關(guān)，尚揭示了單糖殘基間（）（），（）（），（）（），（）（），（）（）的連接位置。等參考文獻(xiàn)，（）：，：，（）：，（）：，（）：張惟杰糖復(fù)合物生化研究技術(shù)第版杭州：浙江大學(xué)出版社，：，（：），（）：，（）：，：，：，（）：，（），（）：，（）：，（）：，（）：，：從

14、孢子中得到一葡聚糖，其和譜通過和得到全部指認(rèn)，并確定了單糖殘基間的連接位置。從中得到一個多糖，通過與實驗，結(jié)合其它二維譜，確認(rèn)了組成多糖的各個單糖的自旋系統(tǒng)小結(jié)多糖為大分子化合物，其結(jié)構(gòu)通常是由若干個單糖組成的重復(fù)單元構(gòu)成，分子內(nèi)，之間、，之間的化學(xué)環(huán)境比較相似，在中的信號重疊嚴(yán)重，因此早期的應(yīng)用于多糖，所提供的信息很少，并未得到足夠的重視，而多糖的結(jié)構(gòu)分析主要依靠于化學(xué)分析法。近年，高磁場儀的出現(xiàn)，使原來低磁場儀上不能分辨的信號得以分開，尤其是的快速發(fā)展，極大的提高了譜峰的分辨率，可以提供多糖結(jié)構(gòu)中單糖殘基的類型、各糖殘基中、化學(xué)位移歸屬，各糖殘基間的連接位置和連接順序等諸多信息，甚至可提供某些多糖結(jié)構(gòu)的全部信息。因此，技術(shù)在多糖中得到了廣泛的應(yīng)用，成為解析其結(jié)構(gòu)不可缺少的工具。食品與藥品Food and Drug年第卷第期魚皮膠原蛋白及膠原活性多肽的研究進(jìn)展郭恒斌，曾慶祝（廣州陸仕水產(chǎn)企業(yè)有限公司，廣東摘廣州；廣州大學(xué)食品工程系，廣東廣州）要：膠原蛋白是生物體內(nèi)的重要蛋白質(zhì)，是結(jié)締組織的主要蛋白質(zhì)成分。膠原蛋白具有多樣性