1、組織培養法在關節軟骨保存中的應用                作者：宋洪強，亓建洪，玄燕華，畢研花 【摘要】  目的探討3種保存方法對關節軟骨細胞活性的不同影響，尋求效果優良的軟骨組織保存方法。方法切取成年豬骨軟骨，制成約4.5 mm×5 mm大小的圓柱形骨軟骨塊。采用組織培養法、慢速梯度降溫冷凍法、傳統慢速連續降溫冷凍法對軟骨塊進行保存處理，觀察并比較保存后軟骨細胞活性的變化。結果保存8周時，采用傳統冷凍法的關節軟骨細胞存

2、活率不足50，軟骨基質成分大量丟失；采用慢速梯度降溫冷凍法的細胞存活率66，而使用組織培養法保存的關節軟骨細胞存活率高達76%以上，軟骨基質成分僅少量丟失。結論3種方法相比較，組織培養法可以長期保存關節軟骨組織活性，是更為理想的軟骨組織保存方法。 【關鍵詞】  關節軟骨； 保存； 組織培養； 活性    Abstract：ObjectiveTo study the effects of different storage method on the viability of cheodroeytes so as to find out the idem

3、method for preservation of articular cartilage.MethodUnder the aseptic condition,acquiring 240 pieces of osteoehondral plugs from both condyles of femur and tibial plateau.The control group was not treatment using any preserved means.The tissue?cultured group was to used F12?DMEM medium long?term pr

4、eserved osteochondral plugs under the conditions of 37 .At preserve 8 weeks,takes the osteochondral section to carry on examination observation ohondrocytes Viability activeness change separately.ResultThe control group chnadrocyte survival rate was 94.4%.At preserves 8 weeks,the cell survival rate

5、of the tissue?cultured group was 76%,the grading?cooling cryopreservation group was 66%,the constant?cooling cryopreservation group only was 41.80%.ConclusionUnder the condition of 37 ,tissue culture method can long term preservation of vital articular cartilage in vitro.The chondrocyte survival rat

6、e of the preservation of vital articular cartilage in vitro.The chondrocyte survival rate of the tissue?cultured method obvious higher than constant?cooling cryopreservation method.    Key words：articular cartilage;  preservation;  tissue?cultured;  viability  

7、;  異體骨軟骨移植物的保存尚無理想的方法，這明顯制約了異體軟骨移植的臨床應用，如何保存軟骨組織的活性，對于保證移植的成功至關重要。因此，作者進行了以下實驗，希望找到更為理想的軟骨組織保存方法。    1  材料與方法    1.1  主要試劑與儀器    F12-DMEM培養基，購于美國Sigma公司；程序降溫儀器：國產RBL?PA?并裥統絳蚶潿騁牽煥潿潮嬉瞧鰨?SANYO-80 深低溫冰箱。    1.2  實驗動物 &#

8、160;  取清潔級健康成年長楓白豬10只20膝，無菌條件下在髕股關節及脛股關節切取正常骨軟骨，制成直徑約4.5 mm、長約5 mm的圓柱形骨軟骨塊240枚。將骨軟骨塊隨機分為4組，每組60枚。備用。    1.3  實驗方法    將骨軟骨塊隨機分為4組，每組60枚。分別為：    對照組：即新鮮軟骨標本不采取任何處理措施，取材半小時內即行組織化學、免疫組織化學觀察和軟骨細胞培養MTT比色法測定存活率。    實驗組包括：  

9、0; 組織培養組（A組）：將取材的骨軟骨塊按體積比115放入配制的普通無菌F12?DMEM混合培養液（含有100 Uml的青鏈霉素，pH值7.27.4）中，放入37 CO2培養箱保存，隔日換液1次。    慢速梯度降溫冷凍組（B組）：將骨軟骨塊浸泡于4 無菌含有15DMSO的玻璃化保護液中浸泡2 h，然后3層無菌血漿袋包裝后進行降溫。先以-1 min的速率從室溫降溫至-4 ，維持30 min，然后以-1 min的速度降溫至-10 并維持30 min，進而以-1 min的速度降溫至-20 ，維持30 min，再連續降溫至-40 ，維持30 min，最后放入-80 深

10、低溫冰箱中保存。    慢速連續降溫冷凍組（C組）：采取文獻1報道的傳統方法，將骨軟骨塊先在4 無菌10 DMSO中浸泡1 h，然后3層無菌血漿袋包裝后進行降溫。首先以-1 min的速率連續降溫至-40 ，再投入-80 深低溫冰箱保存。    保存后處理：實驗組于保存8周時分別取軟骨塊進行指標檢測，冷凍2組軟骨塊自冰箱取出后，立即行37 水浴復溫（復溫速率約100 min）10 s，將標本從包裝袋取出依次投入10、5的蔗糖溶液（37 ）中各停留5 min（洗除融解的凍存液，防止冷凍保護劑對軟骨細胞產生毒性），最后移至PBS液沖洗3遍。

11、組織液培養組從培養液中取出標本，立即在無菌PBS緩沖液中漂洗3遍，清洗掉殘存的培養液。    1.4  實驗指標檢測：    1.4.1  軟骨細胞代謝活性檢測    取20枚標本4多聚甲醛固定36 h，沖洗，10%EDTA脫鈣2周，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，石蠟切片，行甲苯胺藍染色觀察軟骨基質蛋白多糖含量的變化、Collagen 免疫熒光化學染色觀察軟骨基質中Collagen 的變化。    1.4.2  軟骨細胞存活率檢測（MTT比

12、色法）    將其他40枚標本取出后，不經固定處理，切取骨軟骨塊的軟骨層，不帶有軟骨下骨等其他組織，稱重后（每組均稱取1g）將軟骨切成約1 mm×1 mm×1 mm大小的碎塊，移入20 ml的離心管，按三步酶消化分離2進行組織消化。原代軟骨細胞的收獲及計數：將組織消化液經200目濾網過濾入100 ml燒杯中，以DMEM HamF12培養液稀釋，分裝入50 ml離心管，2 000 rmin離心10 min，棄上清。加入適量培養液簡單吹打漂洗后，1 500 rmin離心，5 min，棄上清，重復1次后，加入含體積分數為10FCS的基礎培養液，吹打為

13、均勻的單細胞懸液，取樣3次，以細胞計數板計數，計算平均值及細胞收獲的總數，軟骨細胞原代及傳代培養：取所需量的原代軟骨細胞懸液，以3×104個細胞cm2的密度、含體積分數為10FCS的基礎培養液接種于24孔培養板，置于37 、體積分數為5CO2培養箱內。接種48 h后首次換液，以后隔天換液。當細胞生長至8090融合時，在24孔培養板的6孔中加入0.15 ml MTT溶液，繼續培養4 h。吸取培養液，加入15 ml DMSO，振蕩10 min，使結晶充分溶解。在酶標儀上測定光吸收值（OD值表14），測定波長為490 nm，以只加培養液的6孔作為空白對照。細胞存活率=試驗組光吸收值對照組光

14、吸收值×100。    1.5  統計學分析    所有數據均用x-±s表示，采用SPSS 12.0統計分析軟件進行統計處理，對各組的細胞存活率計量數據資料采用單因素方差分析q檢驗，P0.05表示具有顯著統計學意義。     2  結  果    2.1  軟骨細胞代謝活性的觀察    2.1.1  甲苯胺藍染色結果    對照組可見，正常關節軟骨

15、細胞分散在藍色背景下，甲苯胺藍著色在軟骨深層組織較深，在軟骨淺中層組織顏色較淡，整體軟骨基質異染性明顯（圖1a）。組織保存8周時可見，A組基質異染性較好，甲苯胺藍染色輕度減退（圖1b），B組基質異染性較差，著色中度減退（圖1c）；C組基質異染性差，組織著色明顯減退（圖1d）。    2.1.2  型膠原免疫熒光染色結果    對照組可見，SABC?CY3免疫熒光法標記關節軟骨中的Collagen ，陽性顆粒呈鮮紅色，定位于軟骨基質，大致排列呈“拱形結構”（圖2a）。組織保存8周時可見，A組Collagen 表達的熒光強度輕度

16、降低（圖2b）；B組中度降低（圖2c）；C組重度降低，提示基質中Collagen 大量丟失（圖2d）。    2.2  軟骨細胞存活率的觀察    MTT比色法測定軟骨細胞存活率，在酶標儀上測定光吸收值（OD值）（表14），細胞存活率=試驗組OD值對照組OD值×100。表1  新鮮組OD值表2  組織培養組OD值表3  慢速梯度降溫冷凍組OD值表4  慢速連續降溫冷凍組OD值3  討  論    關節軟骨缺損的修復問題已經困擾

17、人們很多年，同種異體骨軟骨移植對局限性軟骨缺損替代修復是一個很好的方法。張海寧等3研究證實：同種軟骨移植能以類似透明軟骨的結局修復關節軟骨缺損，軟骨細胞生物學特性類似于正常關節軟骨細胞，并且移植的近期效果優于軟骨下骨鉆孔術。但是，軟骨保存尚無理想的方法，這明顯制約了同種異體軟骨移植技術的發展。Schachar報道4同種異體軟骨移植遠期效果不理想可能與以下原因有關：（1）軟骨細胞存活率多大才足以維持軟骨基質的完整性目前尚無定論，但傳統冷凍保存的軟骨細胞約50%的存活率太低；（2）存活軟骨細胞的代謝活性下降，不能合成足夠的基質；（3）冷凍保存損傷了軟骨基質的完整性，而存活的軟骨不能進行修復。如何保

18、存軟骨組織的活性，對于保證移植的成功至關重要。既往保存軟骨的方法常用的有：化學保存方法如用甲醛、酒精、硫柳汞等保存的軟骨均會導致軟骨失去活性，此種無活性的軟骨移植物因其易變性、吸收及排斥反應大等缺點，從而使其應用大為受限。    近年，隨著低溫醫學的發展，冷凍方法成為目前最常用的軟骨保存方法之一。伴隨著冷凍參數、低溫保護劑、冷凍程序等方面的不斷改進，此方法取得了很大進步。但是，隨之發現其雙面性，在保存軟骨活性的同時造成軟骨細胞的巨大傷害。迄今為止，有關冷凍保存軟骨活性的方法，細胞存活率均很低。近年有實驗研究報道5，羊軟骨冷凍保存60 d，軟骨細胞存活率僅為51.6

19、。在本實驗中，采用傳統冷凍保存方法保存豬軟骨組織8周，細胞存活率不足50，這與文獻報道結果有一致性。本研究認為：軟骨基質中含有大量水分，可導致冷凍過程中產生大量的冰晶，明顯損傷細胞活性；軟骨基質的屏障作用，可以減少冷凍防護劑向細胞內滲透的數量，明顯減弱其保護作用。因此，對同種異體骨軟骨移植物保存的傳統方法的改進或者新方法的發明是非常必要的，這對于促進同種異體骨軟骨移植技術的發展具有極為重要的意義。    組織培養技術是一門在體外模擬體內生長條件的基礎上建立的“活體”實驗技術。近年來有學者嘗試用組織培養法保存游離軟骨細胞和皮膚移植片并取得成功。Malinin等6研究

20、認為，在低溫條件下（4 6 ），用組織培養法保存軟骨塊時間不宜超過21 d，否則軟骨細胞存活率會發生時間依從性下降并出現軟骨退變現象。因此，在本實驗中，選用37 條件，使用普通F12?DMEM混合培養液保存關節軟骨，所用的培養條件近似于體內環境，可以避免低溫損傷，在8周的保存期內，未發現軟骨基質包繞現象，軟骨細胞存活率高達75以上，與傳統冷凍保存方法比較有極顯著統計學差異，這一結果令人振奮。實驗結果證明本方法有利于軟骨長期存活而且對軟骨基質成分影響小，方法可靠，經濟，簡便易行。F12?DMEM培養液中含有軟骨細胞所必需的營養成分，與其他培養基相比，還含有微量元素和無機離子，營養豐富，可以不使用血清，就能夠提供軟骨細胞生長所必需的營養物質，滿足細胞存活的需要，能長期維持軟骨細胞活性。而且，在本實驗采用37 條件組織培養法，避免了冷凍保存方法對離體軟骨組織造成的巨大凍傷，較好地保護組織活性，因此是更為理想的保存方法?！緟⒖嘉墨I】  1 李元，張滬生，楊慶銘，等.骨庫的建立及臨床應用J.中華骨科雜志，1995，15（9）：573?574.2 周強