1、附件 5保健食品中9 種脂溶性維生素的測定51BJS 2017171 范圍本方法規定了營養素補充劑類保健食品中維生素A 、維生素 A 醋酸酯、維生素D 2、維生素-串聯質譜本方法適用于營養素補充劑類保健食品中維生素A 、維生素 A 醋酸酯、維生素D2、維生素D3、維生素E、維生素E醋酸酯、維生素 K1、維生素K2、3-胡蘿卜素含量的液相色譜測定方法。D3、維生素E、維生素E醋酸酯、維生素 Ki、維生素K2、3胡蘿卜素含量的測定。2 原理-串聯質試樣經混合溶液（異丙醇：二氯甲烷：甲醇=10:10:80 , v:v:v）提取后，采用液相色譜譜儀檢測，外標法定量。3 試劑和材料除非另有規定，本方法所

2、用試劑均為分析純，水為GB/T 6682 規定的一級水。3.1 試劑3.1.1 甲醇：質譜級。3.1.2 乙腈：質譜級。3.1.3 異丙醇：色譜純。3.1.4 丙酮。3.1.5 二氯甲烷 。50mL，3.1.6提取溶液（異丙醇：二氯甲烷：甲醇=10:10:80, v:v:v）:取異丙醇50mL、二氯甲烷用甲醇稀釋至 500 mL ，混勻。3.1.7 0.1%甲酸水溶液：取甲酸 1 mL 用水稀釋至 1 000 mL ，用濾膜（ 3.4）過濾后備用。3.1.8 0.1%甲酸甲醇溶液：取甲酸 1 mL用甲醇稀釋至lOOOmL,用濾膜（3.4）過濾后備用。3.2 標準品維生素A、維生素A醋酸酯、維生

3、素 D2、維生素D3、維生素E、維生素E醋酸酯、維生素K1、維生素K2、3胡蘿卜素標準品的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子量見附錄A表A.1，純度 98% 3.3 標準溶液配制3.3.1標準儲備液（100卩g/mL3.3.1.1維生素Ki標準儲備液：稱取0.01 g （精確至0.000 1 g）的維生素Ki標準品（3.2）,加入5mL 丙酮（ 3.1.4）溶解,用甲醇轉移并定容于100 mL 棕色容量瓶中。3.3.1.2 3胡蘿卜素標準儲備液：稱取 3胡蘿卜素標準品（ 甲烷（ 3.1.5）溶解,轉移并定容至 100 mL 棕色容量瓶中。3.2） 0.01 g （精確至 0.0

4、00 1 g），用二氯3.3.1.3維生素A、維生素A醋酸酯、維生素D2、維生素D3、維生素E、維生素E醋酸酯、維生的維生素A、維生素A醋酸酯、維生素素K2標準儲備溶液：分別稱取0.01 g （精確至0.000 1 g）D2、維生素D3、維生素E、維生素E醋酸酯、維生素 K2標準品（3.2）,用甲醇溶解，轉移并定容至 100 mL 棕色容量瓶中。3.3.2 空白基質溶液的配制取空白試樣按照試樣制備方法 （5.2）操作。3.3.3 基質標準工作液配制準確吸取標準儲備液（3.3.1）適量，用空白基質溶液稀釋。此溶液中維生素A、維生素A醋酸酯、維生素 D2含量為0.01卩g/mL 0.02卩g/mL

5、 0.05卩g/mL 0.1卩g/mL 0.5卩g/mL,維生素D3含量為0.02卩g/mL 0.05卩g/mL 0.1卩g/mL 0.5卩g/mL 1卩g/mL維生素E、維生素E醋酸酯含量為0.1卩g/mL0.5卩g/mL1卩g/mL5卩g/mL 10卩g/mL,維生素K1 維生素K2含量為0.005卩g/mL0.01g/mL0.05 卩 g/mL0.1 卩 g/mL0.25 卩 g/mL3胡蘿卜素含量為 0.05 卩 g/mL0.1 卩 g/mL0.5g/mL 1 1 g/mL 2.5 i g/mL臨用時配制。注： 操作過程應在避光環境下進行。3.4微孔濾膜：0.22 W,有機相。4 儀器

6、和設備4.1 高效液相色譜 -串聯質譜儀：配有大氣壓化學離子源。4.2 超聲波清洗器。4.3 分析天平：感量分別為0.01 g 和 0.000 1 g。5 分析步驟5.1 試樣制備將 20 粒片劑或膠囊試樣粉碎后混勻,液體試樣混合均勻。5.2 試樣提取準確稱取混合均勻的試樣 2g （精確至0.01 g）于50 mL棕色容量瓶中，加入 40 mL提取溶液（3.1.6）,超聲20 min，冷卻至室溫，用提取溶液（3.1.6）定容至刻度，搖勻，上清液經微孔濾膜3.4）過濾,供液相色譜 -串聯質譜儀測定。注： 操作過程應在避光環境下進行。5.3 儀器參考條件5.3.1色譜條件a)色譜柱：C18柱，1.

7、7 um 100 mmx 2.1 mm （內徑），或性能相當者。b)C）流速：0.5 mL/min。d)柱溫：35C。e)進樣量：5譏流動相：A為0.1%甲酸水溶液（3.1.7） , B為0.1%甲酸甲醇溶液（3.1.8）,洗脫梯度見表1。表1洗脫梯度時間（min）流動相A （%）流動相B （ %）01585301008.501008.5115851015855.3.2質譜條件a)電離方式：大氣壓化學正離子模式。b)檢測方式：多反應檢測（MRM )。C)霧化氣壓力:45psi。d)離子噴霧電壓:4500V。e)干燥氣溫度:200 C （測定維生素 D2）、350 C （測定其余 8種維生素）。

8、干燥氣流速:6 L/min。g)定性離子對、定量離子、碎裂電壓和碰撞能量見表2。表2脂溶性維生素的定性離子對、定量離子、碎裂電壓和碰撞能量中文名稱母離子（m/z）子離子（m/z）碎裂電壓（V）碰撞能量（eV）維生素A269.293.1* ; 81.213522 ; 22維生素A醋酸酯328.193.1* ; 81.213522 ; 22維生素D2397.369.2*; 107.313518 ; 35維生素D3385.3367.2* ; 259.11355 ; 5維生素E431.4165.2* ; 137.31355 ; 40維生素E醋酸酯473.3207.3* ; 165.31008 ; 30

9、維生素K1451.1187.2* ; 57.313520 ; 30維生素K2445.2187.3* ; 81.213520 ; 40&胡蘿卜素538.4177.2* ; 121.310010 ; 20* :定量離子5.4定性測定按照上述條件測定試樣和混合標準工作液，如果試樣中的質量色譜峰保留時間與混合標準工作液中的某種組分一致（變化范圍在戈.5%之內）；試樣中定性離子對的相對豐度與濃度相當混合標準工作液的相對豐度一致，相對豐度偏差不超過表3規定的范圍，則可判定為試樣中存在該組分。表3定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度（%）> 50>2050>1020&l

10、t;10允許的最大偏差（%）±20±25±30±505.5定量測定5.5.1標準曲線的制作將基質標準工作液（3.3.3）分別按儀器參考條件（5.3 ）進行測定，得到相應的標準溶液的色 譜峰面積。以混合標準工作液的濃度為橫坐標，以色譜峰的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。5.5.2試樣溶液的測定將試樣溶液（5.2）按儀器參考條件（5.3）進行測定，得到相應的樣品溶液的色譜峰面積。根 據標準曲線得到待測液中組分的濃度，平行測定次數不少于兩次；試樣待測液響應值若低于標準曲線線性范圍，應取5.2中試樣提取續濾液進行分析；試樣待測液響應值若超出標準曲線線性范圍，應用提

11、取溶液（3.1.6）稀釋后進行分析。標準品液相色譜圖參見附錄B 的圖 B.1-B.9。6結果計算結果按式（1）計算:C XV X 100(1)X =式中:X試樣中某種組分的含量,單位為微克每百克（卩 g/1oog；C由標準曲線得出的樣液中某種組分的濃度，單位為微克每毫升（卩 g/mL;V試樣溶液定容體積，單位為毫升（mL ）;m試樣稱取的質量，單位為克（g）;計算結果以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的算術平均值表示，結果保留三位有效數字。7精密度在重復條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。8其他當稱樣量為2.00 g,定容體積為 50 mL時，維生素 A、維生素

12、A醋酸酯、維生素為8卩g/100g定量限為25卩g/100g維生素D3維生素E檢出限為15卩g/100g定量限為D2檢出限50 卩 g/100g維生素E醋酸酯、維生素 心、維生素K2檢出限為4卩g/100g定量限為12.5卩g/100g檢出限為40卩g/100g定量限為125卩g/100g附錄A脂溶性維生素標準品信息表A.1脂溶性維生素標準品的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子量序號中文名稱英文名稱CAS登錄號分子式相對分子量1維生素AReti nol68-26-8C20H30O286.452維生素A醋酸酯Reti nol AcetateC22H32O2328.491 127-

13、47-93維生素D2Calciferol50-14-6C28H44O396.654維生素D3Cholecalciferol67-97-0C27H44O384.645維生素Ea-Toc op herol59-02-9C29H50O2430.716維生素E醋酸酯Tocop heryl Acetate7695-91-2C31H52O3472.747維生素KiP hytome nadi one84-80-0C31H46O2450.718維生素K2Farnoquinone11032-49-8C16H16O2.(C5H8)3444.6693-胡蘿卜素3-Carote ne7235-40-7C40H 565

14、36.87附錄B脂溶性維生素標準品色譜圖* MRM (269 0 > 93 0) »6 2 CSJ c 呂 a7654-*1.750 min* IMIRMI f?69 0sltnQQ亠 33 0) 56»z d2.335 min.15 ? 2 6Acquisilion Tiime (mmI-1.5225Acqi；i$.iitic>ni Timo min j圖B.1維生素A色譜圖-MRiM (307；0 -> 6蟲0» 盲&2皿圖B.2維生素A醋酸酯色譜圖* MRM 站5 0 裊 3&7 0)酌=7 dX1D5-3.796 mHL0

15、 90 80 7-0 60 50 4 1-04I雪22弓AcqutSitJDn 1 mtj (men) 圖B.3維生素D2色譜圖* IMRMI (431 0 -> 1C5 0> aG-2 d *104.235 min圖MRM iH/3 0xW-III3 544 SAcquiiStjon T ime (mm)B.4維生素D3色譜圖A 207 Q侮 2 d4 575 min1 8-0 9-0曲-0 /-1 41 2-0 6Acquisition T irno (mm)oa-0 60 4-44.&5Acquisition Tirmff(E")slunoQ圖B.5維生素E色譜圖MAM (4511,0 *> 1«7 GJ，sfi三2 d k1Q2,2F5 =2II ,75-II 511.25-3-4 925 rrin圖B.6維生素E醋酸酯色譜圖MRIMI (445 0 宀 1g7 0) sg*3 dMio0. 750O.25JZT42- l./b- 1 51 ?5- fll- 0.75- OS- 0.25-45ArquisiiTion Time (m(in> 圖B.7維生素Ki色譜圖r MRM (537 G -> 1177 0) eG-2 d1 I r I 1 T I4 4244