1、聯(lián)系個(gè)人所學(xué)專業(yè)，選取某種或某類疾病，設(shè)訃相關(guān)實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物模型，詳細(xì)描述其方法及步驟，并闡述所選動(dòng)物種類和級(jí)別的理山以及該動(dòng)物日常生活和實(shí)驗(yàn)的環(huán)境要求(包括進(jìn)出該壞境的順序)，實(shí)驗(yàn)過程中的注童事項(xiàng)MicroRNA-378 (miR-378)在心肌肥片中的研究一實(shí)驗(yàn)原理：microRNA(miRNA)是一類小分子非編碼單鏈RNA,長約22個(gè)堿基，能通過與靶mRNA3TF -翻譯區(qū)(3, UTR)互補(bǔ)配對(duì)，使其翻譯受到抑制，從而在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)生物體內(nèi)基因時(shí)序性表達(dá)起到精細(xì)調(diào)節(jié)作用。miRNA的表達(dá)變化與心肌 肥療的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過異丙腎上腺素和去甲腎上腺素誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物心肌肥厚，然后用

2、PCR技術(shù)測定心肌細(xì)胞中miRNA的變化。二.實(shí)驗(yàn)U的：通過統(tǒng)訃學(xué)方法觀察miRNA在正常心肌細(xì)胞和心肌肥療的心肌細(xì)胞中的差異,從而將miRNA作為診斷心肌肥用的潛在的生物學(xué)標(biāo)志。異丙分別制成三實(shí)驗(yàn)材料及步驟：Wistar雄性大鼠30只(200250g/只，SPF級(jí)別)，腎上腺素(ISO),去屮腎上腺素(NE),生理鹽水。3. 1分組及造模3. 1. 1采用隨機(jī)數(shù)表的方法講30只wistar大鼠隨機(jī)分成三組，每組10只， 為對(duì)照組、ISO處理組、NE組。3. 1.2 ISO處理組：10只大鼠連續(xù)7天背部皮下注射ISO ( 4mg/kg/天人心肌肥朋模型。NE處理組：10只大鼠連續(xù)7天背部皮下注

3、射NE( 4mg/kg/天)，制成心肌肥片模型。對(duì)照組：10只大鼠同法背部皮下注射生理鹽水(4mg/kg/天)，制成心肌肥片 模型。3. 2檢測造模是否成功3. 2. 1高頻超聲檢測分別于造模后第2周，稱取大鼠質(zhì)量，10%水合氯醛麻醉大鼠后，仰臥固定，將其 胸前部剃毛，應(yīng)用T0SHIBA-6000超聲診斷儀，頻率為7. 5 MHz的探頭置于其胸左側(cè)，取 徑(LVEDD, LVESD)o左室射血分?jǐn)?shù)(EF, %)、左室短軸縮 短率(FS, %)、訃算左室左室長軸 切面，圖像深度調(diào)至3. 0 cm, Lh二維超聲引導(dǎo)，將M型超聲取樣線置于二尖瓣腱索水平， 垂直于室間隔及左室后壁，經(jīng)M型超 聲曲線進(jìn)

4、行測量，每一超聲測定值取3個(gè)連續(xù)心動(dòng) 周期測量均值。超聲測量指標(biāo)：舒張末期及收縮末期室間隔療度(IVSTd, IVSVTs).舒張末 期及收縮末期左室后 壁片度(LVPWTd, LVPWTs) 舒張末期及收縮末期左室內(nèi)質(zhì)量(LVM, mg) o322大鼠心肌質(zhì)量指數(shù)的測定稱取大鼠體質(zhì)量(bodyweight, BW),摘眼球取血備用，脫頸椎處死，快速打開胸腔取 心臟，去除心房組織，芳離左、右心室，生理鹽水漂洗去血，用濾紙 吸干表面水分，電 子天平準(zhǔn)確稱取左心室質(zhì)量(left ventricle w&ght, LVV)和 全心質(zhì)量(h artweight, HW)。計(jì)算左心室質(zhì)量與體質(zhì)量

5、的比值(LW/BW)、全心質(zhì)量與體質(zhì)量的比 值(HW/BW),分別記為左心室質(zhì)量指數(shù)(left ventricular weight index , LVWI)和全心 質(zhì)量指數(shù)(heart weight index, HWI 3. 2. 3心肌細(xì)胞橫斷面面積測定 每組隨機(jī)取3只大 鼠，取左心室中段，10%福爾馬林液固定的心肌組織經(jīng)乙醇梯度脫水、透明、浸蠟包埋 后，切成5 口 m的切片，將左心室心肌進(jìn)行HE染色，選擇橫斷心肌的切片(細(xì)胞核清晰，細(xì)胞膜完整)放大400倍。用Image Pro Plus 40圖 像分析軟件，測量左心室心肌細(xì)胞橫斷面面積。每一標(biāo)本隨機(jī)測量20個(gè)心肌細(xì)胞，汁算 其細(xì)胞平

6、均橫斷面面積。3. 3測量miR-378水平3. 3. 1 RNA W：用RNA提取試劑盒提取各組大鼠先前在322中備用 的血中的RNA,切步驟按照試劑盒說明書。3.3.2逆轉(zhuǎn)錄：將提取的RNA作為模板加入到20plPCR體系中，在一定的反應(yīng) 條件下反應(yīng) 成cDNAo 3S3miR378水平的檢測：將3S2中反應(yīng)的cDNA作為模板在20plPCR體系中，在 一定的反應(yīng)條件下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。3. 3. 4用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法比較觀察處理組與對(duì)照組之間miR-378水平差異。五、選擇SPF級(jí)別Wistar雄性大鼠的理山：現(xiàn)已遍及世界各國的實(shí)驗(yàn)室，價(jià)格便宜易 得。10周齡時(shí)雄性大鼠體重可達(dá)280

7、300g,性悄溫順。對(duì)傳染病的抵抗力較強(qiáng)。自發(fā)性腫瘤發(fā)生率低。大鼠是研尤心血管疾病的首選動(dòng)物。SPF動(dòng)物（specific pathogen free animal）即無特定病原體動(dòng)物，指除清潔動(dòng)物應(yīng)排除 的病原外，不攜帶重要潛在感染或條件致病和對(duì)科學(xué)實(shí)驗(yàn)干擾大的病原。飼養(yǎng)在屏障系 統(tǒng)中，是通過無菌動(dòng)物、悉生動(dòng)物而獲得的。籠具、飼料飲水都要經(jīng)過特殊處理，并有 嚴(yán)格的檢疫、消毒、隔離制度。所以科研實(shí)驗(yàn)主要使用SPF動(dòng)物。/V. Wistar大鼠日常生活：晝伏夜動(dòng)2、喜獨(dú)居3、膽小怕驚4、喜啃咬5、抗病力較強(qiáng)6、 敬感性強(qiáng)七、SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)要求：溫度：18遼9度，相對(duì)濕度：50%80% 1

8、2h晝12h夜。1從事SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)大、小鼠的飼養(yǎng)管理工作的飼養(yǎng)員必須經(jīng)過有關(guān)專業(yè)培訓(xùn)，持 證上崗。2每次進(jìn)入屏障環(huán)境前，須用塑料桶內(nèi)配制消毒液，并消毒液擦拭桶壁后，紫外照射20 分鐘后待用。3飼養(yǎng)人員在進(jìn)入屏障環(huán)境前，應(yīng)在外更衣室脫去外衣，除下手表、手機(jī)、飾品等物 品，換拖鞋，洗手（眼鏡）。后進(jìn)入內(nèi)更衣室，穿戴凈化衣、帽、口罩、手套，換拖 鞋。拉開風(fēng)淋室外門，人員進(jìn)入后，立即關(guān)閉外門，風(fēng)淋自動(dòng)啟動(dòng)1分鐘（已設(shè)置），進(jìn) 入清潔走廊。4飼養(yǎng)人員先從清潔儲(chǔ)藏室把動(dòng)物用的籠具、飼料、飲用水等物品經(jīng)清潔走道分配至各區(qū) 域的飼養(yǎng)室。5小鼠飼養(yǎng)籠具的更換周期至少2次/周，飼養(yǎng)人員應(yīng)逐間更換飼養(yǎng)室的飼養(yǎng)籠、飲

9、水瓶， 添加飼料，每次更換下來的籠具、飲水瓶等物品通過污物走廊運(yùn)至緩沖間，然后，擦拭籠 架、地面、側(cè)壁及門把等，檢查飲水瓶有無漏水，噴霧消毒飼養(yǎng)室，再進(jìn)入另一間飼養(yǎng)室 同樣操作。6飼養(yǎng)人員在工作中如發(fā)現(xiàn)有死亡動(dòng)物時(shí)，應(yīng)立即取出動(dòng)物尸體，用塑料袋包裝，記錄籠 號(hào)、動(dòng)物死亡數(shù)、日期，并更換該鼠籠、籠蓋、飼料及飲水瓶，把更換下來的物品及動(dòng)物 尸體一起送至污物走廊前端的緩沖間。7每月第一周周三更換各飼養(yǎng)室的排風(fēng)口濾材，消毒擦拭頂壁、進(jìn)風(fēng)口及燈具罩。8每批動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)把該批動(dòng)物的籠器具拿出屏障環(huán)境清洗，高壓滅菌后再使用。9每次更換籠具工作結(jié)束后，飼養(yǎng)人員應(yīng)檢査各飼養(yǎng)室的門是否全部關(guān)閉，拖拭 清潔走 道、清潔儲(chǔ)藏室、緩沖間、更衣室、次清潔走道的地面，然后走出屏障環(huán) 境外。10在確認(rèn)屏障壞境內(nèi)無人員后，開啟紫外燈，照射20分鐘。八、進(jìn)出該環(huán)境的順序人員：更衣一淋浴一更衣一清潔走廊一飼養(yǎng)室或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室一污 染走廊一洗刷消室-更衣-外部區(qū)域。物品：包裝一高壓消毒（已包裝消毒的可經(jīng)傳遞窗，清結(jié)籠具經(jīng)有消毒液的渡槽）一清 結(jié)準(zhǔn)備室一清潔物品儲(chǔ)存室一飼養(yǎng)室或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室一（污物經(jīng)包裝處理）污染走廊一外 部區(qū)域。動(dòng)