1、    鼠抗人Fas單克隆抗體的制備及鑒定        摘 要 采用Jurkat細胞免疫Balbc小鼠制備了1株抗人Fas mAb 2A1，它能特異性識別Jurkat、Raji、THP-1細胞膜表面50KD左右的蛋白，并能與SrFas標準蛋白反應，其識別的細胞膜蛋白與單抗特異性抗人Fas PcAb N-18相一致。經Ig類與亞類及型檢測試劑盒測定為IgG1、型，雜交瘤細胞染色體數目平均為102。關鍵詞 Fas抗原 單克隆抗體 制備 鑒定中號 R392.11 PRODUCTI

2、ON AND IDENTIFICATION OF A MONOCLONAL ANTIBODY TO HUMAN FAS ANTIGENSong Jianxun， Zhu Xihua， Chen Kemin， Zheng Ping（Department of Immunology， The Third Military Medical University， Chongqing 400038）Abstract A mAb against human Fas（huFas）， designated 2A1， was produced by fusion of the mouse myeloma ce

3、ll line Sp20 with the spleen cells of Balbc mice immunized with Jurkat cells Using Dot-ELISA and western blotting and functional experiments， its was evidenced that anti-huFas mAb 2A1 is specifically directed to huFas and can recognize the Fas protein of about 50KD on Jurkat cells， Raji cells and TH

4、P-1 cells Analysis of Ig classes subclasses and types revealed 2A1 to be IgG1， Key words Fas antigen， Monoclonal antibody（mAb）， Production， IdentificationFasApo-1CD95抗原的發現起始于對兩株mAb的功能觀察，即抗Apo-1 mAb和抗Fas mAb1，2， 由于兩者都能識別細胞膜上CD95蛋白抗原，且能誘導敏感細胞凋亡，才導致了今天對Fas抗原的生物醫學研究。制備抗Fas mAb對于Fas抗原的深入研究，尤其是對Fas抗原信號傳導機

5、制的闡明以及生物醫學應用都有重要意義。本文利用Fas的細胞作為免疫原，功能檢測制備了1株鼠抗人Fas mAb 2A1。1 材料和方法4M次黃嘌呤（H）和16×105M胸腺嘧啶（T）。HAT培養液：HT培養液中加入4×107M氨基喋呤（A）。1.2 細胞系 Sp20小鼠骨髓瘤細胞、Jurkat人T淋巴細胞性白血病細胞、Raji人Burkitt（非洲）淋巴瘤細胞、U937人組織細胞性淋巴瘤細胞為本室保存。THP-1人單核白血病細胞引自中科院上海細胞生物所。各細胞系于含10 NCS的RPMI1640完全培養液中培養傳代。1.3 抗體 單特異性兔抗人Fas多克隆抗體（PcAb）N-

6、18購自Santa Cruz公司。鼠抗人Fas mAb CH-11：Kamiya公司，我室訪美學者鄭力新贈送。HRP-羊抗兔IgG、HRP-羊抗鼠IgG：購自華美公司。1.4 動物 Balbc雌性純系小鼠，68wk，由本校實驗動物中心提供。1.5 其它主要試劑 鼠Ig類與亞類及型檢測試劑盒：IsoStripTM kit購自BM公司。硝酸纖維薄膜（NC膜）：為Gibco公司產品?？扇苄灾亟M人Fas胞外區蛋白（SrFasTM）購自PharMingen公司。融合用試劑：50融合用聚乙二醇PEG（Sigma， MW4 000，含10二甲亞砜DMSO），亮氨酸甲基酯Leu-OMe（Sigma，MW181

7、7），A、H、T（Sigma），8-氮雜鳥嘌呤（Fluka），秋水仙素（Serva）。膜蛋白提取試劑：抑蛋白酶肽Aprotinin （BM），潤濕劑NP-40（Fluka），苯甲基酰磺酰氟PMSF（BM），脫氧膽酸鈉（Serva），十二烷基硫酸鈉SDS和低MW蛋白標準（華美）。1.6 抗人Fas mAb的產生 動物免疫：基礎免疫為Balbc小鼠腹腔注射Jurkat細胞免疫原0.2ml，含2×107細胞鼠，免疫2次，間隔24wk。加強免疫為脾內加強免疫。每脾注射01ml細胞免疫原，含1×106細胞脾。3d后融合。細胞融合、篩選及克隆化：小鼠脾細胞先用25mmol Leu-OM

8、e處理，再與Sp20按101的比例以50 PEG進行融合3。融合細胞用HAT培養液選擇培養，雜交瘤生長后改用HT培養液，融合后10d15d取上清進行篩選。雜交瘤上清對Jurkat細胞生長有毒性作用的孔初步定為陽性孔。克隆及亞克隆化采用有限稀釋法。腹水制備及抗體純化：陽性雜交瘤細胞105腹腔注射石蠟油已致敏的Balbc小鼠制備腹水，飽和（NH4）2SO4鹽析和DEAE纖維素層析相結合純化抗體。1.7 抗人Fas mAb 2A1的鑒定 Dot-ELISA：SrFas抗原標準品點樣于NC膜上，1 BSA封閉后，相繼用雜交瘤腹水和HRP-羊抗鼠IgG作用，DAB顯色，抗人Fas mAb CH-11作為

9、陽性對照。Western Blotting：Fas敏感細胞用PBS洗滌后，用三去污劑裂解液（50molL Tris-Cl， pH80， 150mmolL NaCl， 002 NaN3， 01 SDS， 100mgL PMSF， 1gml Aprotinin， 1 NP-40，05脫氧膽酸鈉）抽提膜蛋白4，經12 SDS-PAGE分離，轉移至NC膜后，相繼用雜交瘤腹水和HRP-羊抗鼠IgG作用，DAB顯色。雜交瘤細胞染色體分析：參照文獻5，即秋水仙素作用獲取雜交瘤細胞染色體中期分裂相，KC1低滲處理細胞，Giemsa染色。Ig類與亞類及型鑒定：按Boehringer Mannheim公司生產的I

10、soStripTM試劑盒說明進行。2 結果2.1 雜交瘤細胞系的建立 用Jurkat細胞作為免疫原制備雜交瘤，分批免疫Balbc小鼠，共72只，前后進行了8次成功融合，平均融合率約80。從3072個雜交瘤生長孔上清中，篩選出對Jurkat細胞生長有抑制毒性作用的孔3個，經克隆及反復亞克隆化后，分別命名為2A1，3B6，3D1。制備上清和小鼠腹水。2.2 Dot-ELISA 經復孔試驗，對雜交瘤細胞系2A1，3B6，3D1小鼠腹水測試發現：僅2A1能與SrFas蛋白反應，斑點陽性對照抗Fas mAb CH-11亦能與SrFas結合并顯色，SP20腹水則顯示陰性結果（見1）。1斑點酶聯免疫吸附試驗

11、Fig 1Dot-ELISA12A1； 23B6； 33D1； 4anti-Fas mAb CH-11；5SP2023 免疫印跡 Jurkat細胞、Raji細胞、THP-1細胞膜蛋白提取樣品經SDS-PAGE后，用考馬斯亮蘭R-250染色液（025考馬斯亮蘭R-250，25異丙醇，10冰乙酸）染色及脫色后，顯示蛋白條帶相似，與U937細胞膜蛋白條帶差異明顯（見2）。經電轉印及免疫染色后發現，雜交瘤腹水2A1能與Jurkat細胞、Raji細胞、THP-1細胞膜蛋白上50KD左右蛋白帶反應，與特異性兔抗人Fas PcAb N-18所識別的位置一致（見3），但在U937細胞膜蛋白帶上未能檢測陽性結果

12、。24 雜交瘤細胞染色體分析 染色體數目平均為102，見4。25 Ig類與亞類及型鑒定 從BM公司試劑盒檢測條帶上顯示，雜交瘤2A1分泌的抗體為IgG1，型。體外傳代3mo及液氮反復凍融，細胞株仍能分泌抗體。2細胞膜蛋白的SDS-PAGEFig 2SDS-PAGE of membrane fractionsA：1U937l；2Jurkat；3Molecular weight standard； 4Raji； 5THP-1B：Jurkat and molecular weight standard3免疫印跡Fig 3Immunobloting analysis of Fas antigen 1M

13、olecular weight standard； 2Anti-Fas PcAb N-18； 3.2A1；42A1 to SrFas； 5Supernatant of SP204雜交瘤細胞染色體（吉氏染色，1 000×）Fig 4The chromosomal morphology of hybridomacells （Giemsas stain， 1 000×）3 討論3.1 Fas抗原的發現 Fas抗原是兩個研究組于1989年同一年在各自的實驗室發現的。一組是德國學者Trauth1所在的研究組為了抑制腫瘤的生長，采用細胞表面分子來控制其增殖；用鼠抗人B淋巴細胞系SKW6

14、.4的單抗，來檢測這些單抗對SKW6.4細胞生長的影響，在幾千個抗體的實驗中，發現抗Apo-1單抗能徹底抑制SKW6.4細胞的生長，并誘導植入裸鼠體內的人B細胞淋巴瘤組織消退。因為Apo-1抗原介導的信號能誘導細胞凋亡Apoptosis，所以抗Apo-1單抗作用的細胞表面分子叫Apo-1抗原。另一組是日本學者Yonehara2所在研究組，發現的細胞表面分子命名為Fas，鼠抗人Fas抗體對表達有Fas抗原的人多種瘤細胞具有類似作用。1991年日本學者Itoh等6從T細胞淋巴瘤KT3株中克隆了Fas cDNA。1992年德國學者Oehm等7也從B細胞淋巴瘤SKW6.4株中純化了Apo-1蛋白并克隆

15、了其cDNA，證實兩者序列完全一致為同一分子。1993年11月在美國Boston召開的第5屆人白細胞分型國際會議上，正式命名Apo-1Fas抗原為CD95。1994年，Suda等利用親和層析技術從鼠細胞毒T淋巴細胞中純化了Fas抗原的天然配體FasL8。由此可知，Fas抗原分子的研究起始于抗Fas mAb的制備，正是由于制備了抗Fas mAb才有了今天對Fas抗原的較深入認識?？笷as mAb能誘導Fas敏感細胞凋亡，有關Fas抗原死亡信號傳導等研究離不開抗Fas mAb的作用。3.2 抗Fas mAb制備中存在的問題 Fas抗原作為細胞膜表面受體，其抗原來源有限，這是抗Fas mAb制備過程

16、中的一大障礙。曾有3種方案在制備抗Fas mAb時用來解決抗原量不足的問題，（1）用生物化學方法從Fas細胞膜上純化Fas蛋白抗原，（2）用化學方法合成Fas抗原胞外區肽段，（3）用Fas細胞直接作為免疫原。開始我們曾提取Fas細胞膜蛋白，試從中純化出部分Fas蛋白抗原，但由于純化量太低且方法不易，以及考慮到純化的Fas抗原蛋白變性，制備出的抗Fas mAb是否能有生物學功能等原因，放棄了第1種方法；用合成肽作為抗原制備抗Fas mAb是最為簡便而有效的方法，由于合成過程中剛好遇上國際上某些合成化學試劑禁運，故這條方法亦被迫停止。因此，我們制備抗Fas mAb采用的是第3種方法，即用Fas細胞

17、作為免疫原，采用功能檢測的方法進行篩選有生物學功能的抗Fas mAb。Fas細胞采用Jurkat T淋巴細胞性白血病細胞，是因為83的Jurkat細胞膜表面Fas抗原表達陽性，比例較高1。Jurkat細胞繁殖較快，傳代容易，易于大量收集用于免疫的細胞免疫原。另外還證實，Jurkat細胞用有絲分裂原PHA或ConA均不能提高其細胞膜表面Fas抗原的表達量，這與國外某些實驗室的實驗結果一致（鄭立新，美國NIH）。用Jurkat細胞作為免疫原免疫Balbc小鼠制備mAb，細胞融合率不高，不超過75。為提高融合率，我們曾采用對Sp20骨髓瘤細胞用20gml的8-氮雜鳥嘌呤處理及用小鼠活體內生長的骨髓瘤

18、細胞進行融合，但效果不理想6。而用Leu-OMe處理免疫脾細胞后再與Sp20融合，則能明顯提高融合率，融合率可達90以上，其機理不詳3。功能檢測用來篩選陽性雜交瘤，在制備抗Fas mAb過程中雖費時、費力，但在沒有足夠純化Fas抗原的情況下亦還有效。制備有生物學功能的抗Fas mAb，即是能誘導敏感細胞凋亡，換言之，能對細胞生長有抑制作用或毒性?；谶@一點，我們對幾千個融合陽性雜交瘤上清進行檢測，尋找對敏感細胞有毒性作用的孔，最終找到3個孔的雜交瘤細胞，由此篩選到1株抗人Fas mAb。第一作者：男，32歲，博士，講師 全軍“九五”重點課題資助項目作者單位：宋建勛 朱錫華 陳克敏 鄭 萍

19、60; 第三軍醫大學免疫學教研室全軍免疫學研究所 重慶 400038  美國哥倫比亞大學參考文獻1 Trauth BC，Klas C， Peters AM， et al Monoclonal antibody-mediated tumor regression by induction of apoptosis Science， 1989，245（4915）：3012 Yonehara S， Ishii A，Yonehara M A cell-killing monoclonal antibody（anti-Fas） to a cell surface antigen co-downregulated with the receptor of tumor necrosis factor J Exp med， 1989， 169（5）：17473 Seo N， Egawa K Utilization of leucine methyl ester for the generation of hybridomas producing monoclonal antibodies specific to tumo