1、重組胸腺素4調節NFB表達促進兔角膜堿燒傷后修復         11-03-04 11:02:00     編輯：studa20                 作者：龍安華,李明,王曉坤,司文,李玄德,聶李亞,馬素永,車永哲,許松山【摘要】  目的：探討重組胸腺素4（Thymosin 4, T4）對角膜堿

2、燒傷后角膜核轉錄因子B（nuclear factor B,NFB）表達的影響和促進角膜愈合的觀察。方法：用1mol/L NaOH浸透的6mm直徑圓濾紙片貼于兔角膜中央30s，建立兔角膜堿燒傷模型。動物隨機分為實驗組和對照組，實驗組給予低中高劑量（0.1,1,10g/50L）T4，對照組給予PBS（陰性對照組）和rhEGF（陽性對照組）皆2次/d滴眼。燒傷后1, 3, 7, 14d肉眼觀察角膜燒傷面積的變化，照相、統計愈合率；免疫組化染色檢測NFB和IL1表達；取燒傷區角膜組織勻漿液提取細胞核蛋白，用ELISA檢測NFB的p65亞基表達水平。結果：角膜堿燒傷后T4用藥組角膜愈合率最高達到33.8

3、%，相應陰性對照組為22.8%，T4用藥組顯著高于對照組（P<0.01），其中中劑量T4組愈合率高于其他劑量組；T4用藥組NFB免疫組化染色積分吸光度明顯低于對照組（P<0.05），ELISA檢測NFB的p65亞基，在T4用藥組中表達最少（P<0.01），IL1免疫組化染色陽性，但實驗組和對照組差異無統計學意義。結論：重組T4促進角膜堿燒傷修復，其機制可能與下調NFB在細胞核內的表達相關。 【關鍵詞】  堿燒傷;創傷愈合;胸腺素4;基質金屬蛋白酶2;血管內皮生長因子AbstractAIM: To investigate the ability of Thymosin

4、 4 (T4) to promote healing in an alkali injury model in vivo and the mechanisms involved in that process which T4 may be a potential antiinflammation agent in this model. METHODS: Corneas of the NewZealand Rabbit were chemically burned with a 6mm disc soaked in 1mol/L NaOH for 30 seconds. Eyes were

5、irrigated copiously with saline and then treated topically with PBS(Negative control group), rhEGF（jinyinshu drop, Positive control group）, and T4 (0.1, 1, 10g/50L) twice daily. At the time point of  1 day, 3, 7, 14 days postburn, the healing rate of the cornea were examined and MMP2, TIMP2, VE

6、GF immunostaining performed.RESULTS:T4treated corneas demonstrated improved cornea healing rate of 33.8% vs PBStreated corneas of 22.8%(P<0.01) , 1g/50L T4 seemed to be the best dosage.  Whereas immunohistochemistry result suggested that T4 decreased corneal NFB expression(P<0.01) after a

7、lkali injury, no change in IL( interleukin) 1 was detected(P>0.05). The enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) result suggested that theres a significant decrease to the NFB protein levels(P<0.01). CONCLUSION: T4 treatment decreases corneal inflammation and inhibits the expression of NFB to

8、 improve cornea healing. The result have important clinical implications for the potential role of T4 as a corneal antiinflammatory agent.KEYWORDS: alkali injury; wound healing; Thymosin beta4; nuclear factorkappa B; interleukin10引言    角膜堿燒傷是一種嚴重的角膜損傷。研究顯示，角膜堿燒傷后許多促炎因子和細胞趨化因子表達增加1,這些促

9、炎因子表達的增加導致角膜損傷部位白細胞和單核細胞浸潤，組織破壞和溶解作用會導致角膜愈合的延遲。TNF和IL1是非常重要的調節炎癥程度的細胞因子，它們在感染、組織損傷、惡性腫瘤和細胞凋亡等過程中通過啟動炎癥反應來抵抗外來物入侵2，但失控的炎癥反應往往導致組織自身損傷，不利于組織愈合3。T4是G肌動蛋白偶聯蛋白，最近研究表明T4能夠調節肌動蛋白平衡，促進多種細胞遷移4,5，抑制炎癥過度表達6，抑制細胞凋亡7等；在促進皮膚創傷愈合8，保護和修復心肌，促進角膜堿燒傷后修復9以及促進毛囊干細胞生長等方面具有很好的促進和調節作用。近年來研究顯示T4和其變異體Sulfoxide T4，splicevaria

10、nt T4均有抑制炎癥因子和促進組織創傷愈合的作用10,11。T4在大鼠角膜清創術后能調節IL1和IL8表達并促進角膜再上皮化和角膜愈合，促炎因子TNF和IL1可以激活NFB，NFB是Rel家族的同源蛋白，最重要的兩個亞基是p65和p50，被激活后以二聚體形式轉位至細胞核內發揮轉錄因子活性，與細胞炎癥過程密切相關。在角膜堿燒傷中NFB的抑制劑SN50能加速角膜上皮細胞增殖促進角膜愈合12，Sosne等6首次報道T4具有對NFB的抑制作用，可以調節角膜堿燒傷后炎癥反應的程度，是T4促角膜修復的可能機制。我們觀察T4促進角膜堿燒傷后角膜愈合的情況下，并探討T4是否通過調節NFB的機制發揮其抗炎作用

11、。1材料和方法1.1材料 健康成年新西蘭白兔（軍事醫學科學院實驗動物中心提供），2.03.0kg，雌雄不限。60只動物隨機分為實驗組和對照組，實驗組又分低劑量（0.1g ）、中劑量（1g）、高劑量（10g）組，對照組分為PBS陰性對照組和rhEGF陽性對照組，每組12只，分別在1,3,7,14d各處死3只，快速取材完整兔角膜。重組T4由北京諾思蘭德生物技術有限公司提供，rhEGF滴眼液商品名為“金因舒”，由深圳市華生元基因工程發展有限公司生產（國藥準字S20040006），抗兔IL1一抗由武漢博士德生物工程有限公司提供，抗兔NFB一抗由santa cruz Biotechnology

12、, Inc提供，過氧化物酶和二抗等免疫組化試劑以及ELISA試劑盒均由天津灝洋生物制品科技有限公司提供。1.2.1兔角膜堿燒傷模型制作 實驗動物用20g/L利多卡因2mL局部浸潤麻醉，自制開瞼器開瞼，用在40g/L NaOH浸透的直徑為6 mm的圓濾紙片貼于兩眼角膜中央，30s后迅速用無菌生理鹽水沖洗5min，建立角膜堿燒傷模型。每天分別用3種劑量的T4、無菌PBS和rhEGF滴眼液早晚兩次滴眼。分別在1,3,7,14d取材，部分組織迅速固定于40g/L多聚甲醛固定液24h，經常規石蠟包埋，行水平連續切片（5m），部分組織迅速冷凍備用。1.2.2角膜愈合率檢測 對14d取材

13、的實驗動物，角膜堿燒傷后每隔1d拍照角膜燒傷部位，Motic 3.0計算角膜愈合率,角膜愈合率=（1取材時角膜損傷面積/原始角膜損傷面積）×100%。1.2.3 NFB和IL1表達的檢測 每個角膜標本取1張切片行HE染色，觀察組織學形態。再各取1張行NFB和IL1免疫組化染色，一抗（150）4孵育過夜，相應的生物素標記的二抗（1200）室溫45min，SP復合物室溫孵育45 min，DAB顯色，顯微鏡下控制并嚴格控制各組的反應時間，Mayer蘇木精對比染色1min，常規封片。顯微鏡（Leica DM RXA2）觀察并取角膜中央和角膜緣各3張圖片，用于圖像分析。1.2.4細胞核內NFB蛋白水平的檢測 在各時間點取角膜組織后立即冷凍于70，液氮冷凍條件下研磨組織，再分別用自配胞質裂解液和胞核裂解液抽提胞質蛋白和胞核蛋白，胞核蛋白用于ELISA檢測NFB蛋白的p65亞基表達情況，操作均按試劑盒說明步驟進行。    統計學分析:對免疫組化染色的切片每組動物各取5張，顯微鏡照相取圖時按照兩角膜緣和損傷中央部位各取3張圖，用Motic 3.0圖像分析軟件分析平均積分吸光度（IOD/Area），行兩