1、TGF-1基因修飾誘導脂肪干細胞成軟骨分化的實驗研究                 作者：王洪林，閔繁紅，王巖峰，謝永，張金剛，欒洪佳，侯旭東【摘要】   目的本研究通過選擇對軟骨細胞ECM合成具有促進作用的TGF-1轉染脂肪干細胞（ADSCs），觀察轉染后目的基因的穩定表達和對軟骨細胞外基質(ECM)的兩種重要組分：型膠原(type collage, Col)和aggrecan的合成，為構建新型的 組織 工程軟骨提供實驗依

2、據。方法TGF-1基因轉染脂肪干細胞及陽性細胞克隆株的篩選; RT-PCR檢測TGF-1、纖連蛋白(fibronectin,FN)、Col、Aggrecan的表達； Western -blot檢測TGF-1。結果RT-PCR結果顯示：實驗組（TGF-1穩定轉染組）的TGF-1、FN、Col、Aggrecan的表達較空染組和正常對照組均明顯增多（P< 0. 01）；Western blot檢測實驗組（TGF-1穩定轉染組）TGF-1蛋白的表達較空染組和正常對照組均明顯增多（P< 0. 01）。結論成功分離培養脂肪干細胞；以脂質體介導法將TGF-1目的基因成功轉染ADSCs，轉染后成軟

3、骨分化的特異性細胞外基質增多，表明轉染TGF-1基因可以促使ADSCs向軟骨細胞方向分化，從而為軟骨組織工程提供新的思路和方法。 【關鍵詞】   轉化生長因子1（TGF-1）； 脂肪干細胞（ADSCs）； 基因轉染； RT-PCR； Western-blot    Abstract: ObjectiveTo induce TGF-1 gene which can increase ECM synthesis into adipose tissue derived stem cells（ADSCs） by employing gene transfer t

4、echniques and observe whether TGF-1 gene could expresse continuously and whether type II collagen and aggrecan are synthesized in order to provide experimental data for constructing tissueengineering cartilage. MethodADSCs were transferred with TGF-1 gene ,TGF-1,FN,Col and aggrecan were detected wit

5、h RT-PCR and TGF-1 prot Ei n was detected with Western-blot.ResultRT-PCR demonstrated that the expression of TGF-1,FN,Col and aggrecan in the TGF-1 gene transferred groups increased more evidently than nongene groups and control groups (P< 0. 01). Western blot demonstrated that TGF-1 prot EI n in

6、 the TGF-1 gene transferred groups increased more evidently than non gene groups and control groups significantly (P< 0. 01). ConclusionADSCs of Wistar rats could be separated and cultured successfully. After TGF-1 gene was transferred stably into ADSCs, the specific extracellular matrix of chond

7、rocyte differentiation increased evidently. The results demonstrated that TGF-1 gene could induce ADSCs into chondrocytes.The experiment provides a new methed for constructing tissueengineering cartilage.    Key  words：transforming growth factor-1（TGF-1）;  adipose tissue der

8、ived stem cells(ADSCs);  gene transfection;  reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR);  Western-blot     TGF-1對ECM的形成有重要作用。TGF-1能促進體外培養軟骨細胞合成II型膠原，有研究表明它可以促進ADSCs的軟骨分化1 。但體外培養中添加TGF-1易流失，且TGF-1因子價格昂貴，為維持細胞表型和防止細胞退變，需不斷添加TGF-1，因此結合 應用 轉基因技術，將能夠促進軟骨細胞E

9、CM合成的目的基因導入其中，以此為種子細胞構建一種基因修飾的組織工程軟骨(gene modified tissue engineering cartilage)無疑非常具有意義。本研究試圖通過選擇對軟骨細胞ECM合成具有促進作用的TGF-1轉染脂肪干細胞，觀察轉染后目的基因的穩定表達和對軟骨細胞ECM的兩種重要組分:II型膠原(type collage, Col)和aggrecan的合成，為構建新型的組織工程軟骨提供實驗依據。    1  材料與方法    1.1  實驗材料    1

10、.1.1  實驗動物    Wistar大鼠（ 中國 醫科大學實驗動物部提供）    1.1. 2  主要試劑    pSNAV質粒、pSNAV- TGF-1真核表達質粒購自北京本元正陽生物公司; DH-5菌種由中國醫科大學微生物教研室提供；Lipofectamine2000購自Invitrogen公司；胎牛血清、高糖DMEM、 G418、Trizol購自GIBCO/BRL公司；DL2000標準分子量、質粒快速提取試劑盒（中量）、RNA PCR Kit(AMV)Ver 3.0試劑盒購自

11、大連寶生物工程公司；TGF-1兔多克隆抗體和-actin兔多克隆抗體購自Santa Cruz公司；堿性磷酸酶標記的羊抗兔單克隆抗體購自北京中杉生物技術有限公司。    1.1.3  主要儀器設備    PCR儀（Biometra Unio 型，德國）；多功能電泳儀（Multiphor型,瑞典）；紫外分光光度計（UV-3000型，英國）；凝膠自動成像及分析系統（Chemi Imager 5500，美國）；水浴式轉印電泳槽（DYY-40B型 北京六一儀器廠）；臺式離心機（Sigmal-13,美國）；勻漿機（Heidolph DI

12、AX600，德國）。    1.2  實驗方法    1. 2. 1  質粒DNA的擴增、提取    大腸桿菌菌株的復蘇與培養，感受態細菌的制備，質粒DNA的轉化，質粒DNA菌株的篩選，質粒DNA中量的提取（即轉基因用超純質粒的制備），按照質粒提取試劑盒的說明進行操作。    1.2. 2   TGF-1基因轉染脂肪干細胞及陽性細胞克隆株的篩選    取成年雄性Wistar大鼠腹股溝處脂肪組織，仔細清除假包

13、膜、血管、結締組織，在超凈 工作 臺中，將組織剪碎，加入0.25%的型膠原酶消化3 h，1 200 r/min離心5 min，含15%FBS的高糖DMEM培養基稀釋，紗巾過濾，離心，將細胞收集到12瓶50 ml培養瓶中培養。細胞長滿80%用0.125%/EDTA胰酶消化傳代培養。選取第2代脂肪干細胞，5×105細胞傳至35 mm平皿中，37,5%CO2培養至細胞密度為90時進行轉染，轉染前一天更換2 ml不含抗生素的正常生長培養液；用250 l DMEM無血清培養基稀釋4 g質粒（pSNAV-TGF1，pSNAV）溫和搖勻；輕輕混勻Lipofectamine 2000,將10 l L

14、ipofectamine 2000加入250 l DMEM無血清培養基中混勻并于室溫溫育5 min；5 min溫育后，混合稀釋的質粒DNA和稀釋的Lipofectamine 2000，混勻，室溫下放置20 min，以使DNA/ Lipofectamine 2000復合物形成；將DNA/ Lipofectamine 2000復合物加入含有細胞和培養基的孔中，搖動培養皿，輕輕混勻；6 h后更換完全生長培養液；轉染1 d后，將細胞按110的稀釋比例傳代至新鮮生長培養液中，第2 d加入G418 400 g/ml進行篩選；篩選21 d后克隆形成，將其挑至24孔板，生長至融合，轉移至6孔板，最后轉至50

15、ml培養瓶中。    1. 2. 3  RT-PCR檢測TGF-1、FN、Col、Aggrecan    提取總RNA  按照Trizol試劑盒說明書進行；RT-PCR參照Genbank的cDNA序列，采用Primer Premier 5.0 軟件 設計引物，委托大連寶生物技術有限公司合成    TGF-1  5' CTGTGGCTACTGGTGCTGAC 3'    5' CATAGATTTCGTTGTGGGTTTC 3

16、'    FN5' ACCACCCAGAACTACGATGC 3'    5' GATGGGGTCACATTTCCATC 3'    Co5' GCGAGTCTTGCGTCTACCC 3'    5' ACATCATTGGAGCCCTGGAT 3'    Aggrecan5' CAGTCTACCCAGCACCCTACA 3'   

17、 5' CGGGAAAGTGGCGATAACA 3'    進行反轉錄反應；按下列條件進行反轉錄反應：30,10 min,42,30 min,99,5 min,5,5 min,進行1cycle；按下列條件進行PCR反應：94，2 min，1cycle；94，30 s，55，30 s，72，1 min，72，7 min，32 cycle；反應結束后，取PCR反應液進行瓊脂糖凝膠電泳。    1. 2. 4  Western blot檢測TGF-1    胞漿蛋白的提取采用Folin

18、-酚試劑法進行蛋白定量；Western 印跡雜交，取50 l蛋白樣本，在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，120 V，1.5 h。電泳結束后遵循膜正極膠負極的原則，在水浴式電轉印槽中轉印至硝酸纖維素膜(NC)上(電壓50V電流100 mA，2 h)。轉印結束后再TBS液洗膜10 min，以5%的脫脂奶粉封閉過夜。再以TTBS洗2次，每次5 min,分別加入TGF-1兔多克隆抗體（1400，Santa Cruz）和-actin兔多克隆抗體（1400，Santa Cruz），4過夜。TTBS洗滌2次，每次5 min后，與堿性磷酸酶標記的羊抗兔單克隆二抗（12000，北京中杉公司）室溫孵育2 h，加入堿

19、性磷酸酶底物O-dianidine及-naphthyl acid phosphate,顯色液顯色15 min。顯色的硝酸纖維素膜(NC)經UPV掃描儀掃描成像，用UPV凝膠分析系統 計算 曲線下面積得到灰度值。    1. 3  統計 學分析    統計采用X2分析，應用SPSS 12.0軟件進行統計分析。    2  結果    RT-PCR結果顯示:TGF-1目的基因轉染組較未轉染組和轉染空載體組，其TGF-1、FN、Col II、Aggrecan的m

20、RNA表達增強(圖1、2、3、4，表1)。表1  RT-PCR檢測TGF-1、FN、Col 、Aggrecan（NI比值）組別TGF-1FNColAggrecan未轉染組0.390±0.0330.655±0.0510.276±0.0160.508±0.063轉染空載組0.344±0.0390.639±0.0480.325±0.0120.520±0.041轉染組0.920±0.0560.935±0.0631.009±0.0370.895±0.056P值0.0000.0

21、000.0000.000    Western-blot結果顯示：轉染TGF-1組較未轉染組和轉染空載體組，其TGF-1蛋白表達量明顯增高（圖5，表2）    在原代培養的ATSCs中，多數為成纖維細胞樣細胞的短梭形，少數為多角形（圖6）。經傳代培養后多角形細胞明顯增多，且細胞呈克隆樣聚集生長。TGF-1基因轉染后的ADSCs，部分細胞變為圓形或橢圓形（圖7）。 表2  Western-blot檢測TGF-1組別3  討論    在脂肪 組織 里發現并提取多向分化干細胞則最早于2001

22、年由Zuk PA和 Zhu Min2從人抽脂術中抽取的脂肪組織懸液中分離獲得。由于脂肪組織來源干細胞(ADSCs)取材容易，并且可以把抽脂術中過去都扔掉的脂肪組織懸液變廢為寶，成為人干細胞庫的重要來源，可在局麻下通過腹部的吸脂術獲得，對患者損傷較小，且獲取相對容易，對肥胖者尤其適合。因此雖然發現較晚，但研究非常迅速深入。目前已經證實ADSCs能向脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞、肌肉細胞及心肌細胞定向誘導轉化,可作為多種組織工程的種子細胞，有非常重要的研究和 應用 價值。國內余方圓3從兔脂肪組織中分離出干細胞，并將脂肪干細胞向軟骨方向轉化。Mochizuki等4利用脂肪干細胞在體內外成功構建了組織

23、工程軟骨,使之成為了軟骨組織工程領域又一理想的種子細胞。    基因轉染常用的載體有:病毒載體，包括逆轉錄病毒、腺病毒和腺病毒相關病毒(adeno associated virus, AAV)，該類載體具有易于轉染各種體細胞、可獲得高滴度病毒等優點，是目前基因轉染技術中應用最為廣泛的載體，但具有潛在致癌、產生針對病毒蛋白而發生的免疫反應和因劑量過大而產生毒性的危險。本研究選用脂質體為載體，因其與細胞膜結構十分相似，也極易附著于細胞膜。以脂質體為載體的目的基因隨脂質體進入胞漿而被導入細胞核內，該類載體無毒性和致癌等危險，經在RNA和蛋白質水平檢測，均證實轉染成功。基

24、因工程技術應用于組織工程領域有其獨特的優勢:轉化細胞可持續高效表達目的基因以調控其自身及其它效應細胞的生長;轉染細胞合成分泌的內源性蛋白具有更多可識別的配體，能更有效地同細胞表面受體結合使其表達產物活性更高，所需產物量更小(ng或pg水平)，減少了外源性重組蛋白(mg或g)反復使用的副作用等。價格遠低于純化的重組蛋白。因此，結合應用轉基因技術，將能夠促進軟骨細胞ECM合成的TGF-1基因導入其中，以此為種子細胞構建一種基因修飾的組織工程軟骨無疑非常具有意義。    TGF-1 是一族具有多種功能的多肽類生長因子，可以調節多種細胞的生長和分化。在胚胎軟骨形成過程時，

25、TGF-1 可以誘導原始的間充質干細胞分化形成軟骨組織，并具有促進軟骨細胞增殖和成熟，增加軟骨細胞合成和分泌蛋白多糖的作用5。Worster對間充質干細胞( marrow mesenchymal stem cells, MSCs)體外培養時發現，在培養基中加入TGF-1可以誘導MSC定向分化為軟骨細胞，其II型膠原的表達與TGF -1的劑量呈正相關，510 ng/ml的TGF-1可有效地促進MSCs向軟骨方向的分化6。TGF- 1 濃度達到10ng/ml 可使型膠原、Aggercan 等因子的表達量提高2 倍以上, 促使ATSCs 向軟骨方向分化1。主要通過兩種途徑促進軟骨細胞生成：（1）促進

26、干細胞分化為軟骨，TGF-1 能誘導MSCs 轉化為軟骨細胞,并促進其增殖,同時還能抑制成熟軟骨細胞的增殖和分化。Liechty 等7 研究發現,在大鼠胚胎中的間充質干細胞和骨膜來源細胞中,TGF-受體可大量表達,能促進軟骨細胞合成蛋白多糖和型膠原,維持軟骨細胞表型穩定。（2）促進軟骨特異性基質的合成。Pittenger 等8 研究表明, TGF- 能增加GAG 的合成, 同時也可改變GAG 的糖基模式,使硫酸軟骨素鏈加長,磷酸化程度更高,從而使GAG 更加致密和富有彈性,符合軟骨的生理特性。TGF-不僅能刺激膠原合成,而且作為一種強力趨化因子,可增加細胞外骨基質,對于調節骨與軟骨形成有重要作

27、用9 。因此，TGF-1是誘導干細胞向軟骨分化的首選因子。    TGF-家族由40多個多肽構成，具有高度同源性，尤其梭基端7個保守片段。TGF-超家族的細胞因子對成軟骨誘導分化的作用主要通過兩種細胞內信號路徑來轉導。第1種路徑主要涉及信號分子SMAD家族10，第2種路徑主要涉及活化蛋白激酶信號路徑11。這兩種信號的級聯放大作用都是通過相同的TGF-受體復合體激活的。這種復合體由兩種不同的跨膜蛋白組份(型和型受體)，通過異二聚體化和TGF-超家族的細胞因子結合。研究表明成軟骨分化時通過TGF-激活的信號級聯放大和Wnt路徑在調控上存在交聯關系12。 TGF-超家族

28、生物活化的調控是通過和細胞外基質蛋白如-聚糖等相結合產生的相互作用來實現的13。通過改變細胞因子和相應細胞表面受體的結合來調控TGF-超家族生物活化。    脂肪干細胞的定向分化有二條調節途徑，為內源性調控和外源性調控。應用外源性添加TGF-1誘導ADSCs成軟骨分化的研究中發現，該因子可以促進細胞外基質的合成，誘導ADSCs成軟骨分化14，本研究中，TGF-1目的基因轉染ADSCs后，能夠促使纖連蛋白(FN)的合成增強,促進其成軟骨分化的特異性細胞外基質Col, Aggrecan表達量顯著增強；從內源性調控途徑證實TGF-1基因修飾可以誘導ADSCs成軟骨分化，

29、從而為構建組織工程軟骨提供新的思路和方法。【 參考 文獻 】   1 Awad HA, Halvorsen YD, Gimble JM, et al. Effects of transforming growth factor beta1 and dexamethasone on the growth an chondrogenic differentiation of adipose derived stromal cellsJ. Tissue Eng, 2003, 9: 1301-1312.2 Zuk PA, Zhu Min,Mizuno H, et al. Multilinea

30、ge cells from human adipose tissue: implication for cell-based therapiesJ. Tissue Engineering, 2001,7:211-227.3 余方圓，盧世璧，袁玫，等.脂肪干細胞向軟骨細胞方向誘導的初步研究J. 中國 矯形外科雜志，2004,12:762-764.4 Mochizuki T，Muneta T，Sakaguchi Y，et al.Higher chondrogenic potential of fibrous synovium-and adipose synovium-derived cells c

31、ompared with subcutaneous fat-derived cells:distinguishing properties of mesenchymal stem cells in humansJ.Arthritis Rheum,2006,54:843-853.5 Van den Berg W ,van den Kraan P, Scharstuhl A,et al.Growth factors and cartilage repairJ. Clin Orthop Relat Res, 2001, 391:244-250.6 Worster AA, Nixon AJ, Brow

32、er-Toland BD,et al.Effect of transforming growth factor beta l on chondrogenic differentiation of cultured equine mesenchymal stem cellsJ. Am J Vet Res, 2000 ,61:1003-1010.7 Liechty K W,Mackenzie T C ,Shaaban A F,et al.Human mesenchymal stem cells engraft and demonstrate site- specific differentiation after in utero transplantation in sheep J.Nat Med,2000,6:1282 -1286.8 Pittenger M F ,Mocsca J D ,Mcintosh K R.Human mesenchymal stem cells:progenitor cells for cartilage ,bone ,fat and stromaJ.Curr Top Microbiol Im