1、關(guān)于鱟試劑在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中使用的探討鱟試驗因其簡單快速靈敏準(zhǔn)確的特點，被世界各國廣泛采用，中國藥典和歐美藥典將其定為法定的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，大范圍地替代了熱源檢查法。為了確保其檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性，本文對鱟試劑的使用進(jìn)行了探討，以規(guī)范鱟試劑的正確使用。 【關(guān)鍵詞】  鱟試劑;細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法【Abstract】 TAL reagent test because of its simple, fast and accurate characteristics was widely adopted around the world. Chinese Pharmacopoeia, Euro

2、pean and the United States Pharmacopoeia set it as the statutory bacterial endotoxins test, replaces the pyrogen test on a large scale. In order to ensure the accuracy of test results, the main discussion of this paper is the use of tachypleus tridentatus leach(TAL),to regulate the proper use of TAL

3、.【Key words】 TAL;bacterial endotoxins test1 鱟試劑的分類鱟試劑是從棲生于海洋的節(jié)肢動物“鱟”的藍(lán)色血液中提取變形細(xì)胞溶解物，經(jīng)低溫冷凍干燥而成的生物試劑，專用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢測。1.1 按原料來源分 一種是由美洲鱟血液提取的稱美洲鱟試劑(Limulus Amebocyte Lysate)，縮寫為LAL，由美國生產(chǎn);另一種是由東方鱟血液中提取的稱東方鱟鱟試劑(Tachypleus Amebocyte Lysate)，縮寫為TAL。TAL與LAL有相同的功效。1.2 按實驗方法分 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法包括兩種方法，即凝膠法和光度測定法，后者又包括濁度法和顯色基

4、質(zhì)法1。則鱟試劑可分為：凝膠法鱟試劑、動態(tài)濁度法鱟試劑、終點濁度法鱟試劑、動態(tài)顯色法鱟試劑和終點顯色法鱟試劑。凝膠法鱟試劑通過與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來定性檢測或半定量內(nèi)毒素的方法。動態(tài)濁度法鱟試劑、終點濁度法鱟試劑、動態(tài)顯色法鱟試劑和終點顯色法鱟試劑則都是定量檢測內(nèi)毒素的。1.3 按使用特點分 普通鱟試劑 靈敏度0.50.125EU/ml，適用于僅需要檢測內(nèi)毒素限量的樣品。 高靈敏度鱟試劑 靈敏度0.060.015 EU/ml，適用于內(nèi)毒素限量較低的樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。 特異性鱟試劑 靈敏度0.50.015EU/ml，適用于成分較為復(fù)雜，會對鱟試劑產(chǎn)生干擾的樣品2。 定量法鱟試劑 最低檢測

5、限0.030.005 EU/ml，適用于需要對內(nèi)毒素進(jìn)行定量測定的樣品。2 鱟試劑在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中的正確使用內(nèi)毒素檢查法結(jié)果準(zhǔn)確與否與所用鱟試劑的靈敏度相關(guān)性很大3，而鱟試劑的靈敏度與它的正確使用又密切相關(guān)。所以，一定要嚴(yán)格執(zhí)行鱟試劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)范使用鱟試劑。2.1 保證所使用鱟試劑的質(zhì)量 鱟試劑的質(zhì)量主要表現(xiàn)在其靈敏度、自凝時間與成膠狀態(tài)三個方面：靈敏度穩(wěn)定;自凝時間不低于24h4;具有一定的緩沖能力與合適的pH;反應(yīng)后即形成堅實凝膠，將成膠安瓿翻轉(zhuǎn)180°而不會被破壞。而質(zhì)量稍差的鱟試劑存放一定時間后(如半年)其靈敏度可能發(fā)生變化，而靈敏度的改變會使測定結(jié)果所反映的供試品中

6、內(nèi)毒素的允許限值發(fā)生變化5。因此，需選擇具有國家頒發(fā)的批準(zhǔn)文號,質(zhì)量穩(wěn)定的鱟試劑。2.2 對鱟試劑靈敏度進(jìn)行監(jiān)測性復(fù)核 由于不同廠家鱟試劑質(zhì)量不盡相同，即便是相同廠家不同批號的鱟試劑也有差異,這便導(dǎo)致鱟試劑靈敏度復(fù)核值與標(biāo)示值不盡一致，因此鱟試劑的復(fù)核值對檢測結(jié)果有顯著影響6。每使用新批號鱟試劑時應(yīng)復(fù)核其靈敏度;對留樣鱟試劑自生產(chǎn)之日起，每6個月進(jìn)行一次靈敏度檢測，其靈敏度在有效期內(nèi)應(yīng)符合規(guī)定。有研究表明，鱟試劑的靈敏度在符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定及適當(dāng)?shù)馁A存條件下,3年內(nèi)其靈敏度變化不大，是穩(wěn)定的。建議可適當(dāng)延長其有效期7,8。因此，對鱟試劑靈敏度進(jìn)行監(jiān)測性復(fù)核有利于確保實驗的準(zhǔn)確性，同時可以最大程度地使

7、用鱟試劑。2.3 使用過程正確操作 選擇合適的操作方法與順序，在鱟試劑的使用過程中尤為重要。在操作過程中要注意以下幾點：(1)實驗室要求潔凈、無塵埃流通;檢驗人員同時注意衛(wèi)生的保持。在整個使用操作過程中應(yīng)防止微生物的污染，例如空氣的流動，人員的口沫、汗液污染等。(2)鱟試劑開啟、溶解和配制時應(yīng)盡量避免將安瓿外瓶壁臟物、瓶壁碎片、砂輪鋸屑等異物混入鱟試劑中，避免鱟試劑外損。(3)鱟試劑中含有多種蛋白質(zhì)，用力振搖會產(chǎn)生氣泡，一旦起泡難以消除，而影響檢測的準(zhǔn)確性，所以在整個操作過程中都要輕力以避免因過分震動而引起的誤差。(4)量取和加樣反應(yīng)物時，一定要加到試管底部接近鱟試液而不接觸鱟試液的管壁處。(

8、5)生成凝膠的最適pH值為68，對于氯化鈉注射液、葡萄糖注射液(5%,10%)等注射液，不需考慮供試液的pH值，而檢查其他制劑時，尤其是一些本身緩沖能力較強或偏酸、堿的供試品，應(yīng)考慮供試品的pH值5。(6)使用時要嚴(yán)格控制溫度和時間。當(dāng)鱟試劑一加入內(nèi)毒素及樣品混合液中時反應(yīng)已開始，并在一定的溫度范圍內(nèi)，反應(yīng)溫度越高，反應(yīng)速率越大;保溫時間的增長，也會提高鱟試劑的靈敏度，增加假陽性的發(fā)生9，導(dǎo)致較大誤差。因此，要注意控制溫度的變化和保溫時間。(7)保持實驗器具的潔凈。每次檢驗完畢，應(yīng)及時將玻璃器具充分清洗后于250干熱滅菌處理，待烤箱溫度升至設(shè)定的溫度后開始計時，干烤至少1h10。也可用其他經(jīng)確

9、證不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查的適宜方法。對于塑料、橡膠等不耐熱器材可用30%雙氧水浸泡4h，用無熱原水沖洗，70干燥備用。2.4 鱟試劑的貯存 雖然凍干的鱟試劑在常溫條件下是相對穩(wěn)定的，但還是應(yīng)存放在28下，避免長時間放置在高于25的溫度條件下導(dǎo)致因貯藏不當(dāng)、質(zhì)量下降而引起的檢驗誤差。3 建議3.1 一般中草藥注射液由于成分復(fù)雜，以及含糖注射液中常含有-葡聚糖11，使其干擾因素較多。而使用特異性鱟試劑，可利用其能夠屏蔽-葡聚糖引起的鱟試劑凝聚反應(yīng)，僅與內(nèi)毒素反應(yīng)的原理，以消除干擾1214，從而減少或消除假陽性反應(yīng)15。3.2 當(dāng)夏天室溫較高時，控制鱟試劑使用過程中溫度的變化，可通過在冰水浴中進(jìn)行加

10、樣以取得較好效果;同時，實驗操作從鱟試劑的復(fù)溶到放入恒溫儀應(yīng)盡量在1.5h內(nèi)完成。3.3 雖然目前的鱟試劑相對穩(wěn)定很多，但還是應(yīng)存放于28的條件下，并保持溫度的穩(wěn)定，如冰箱發(fā)生故障，無法保持溫度時，就應(yīng)及時更換貯存設(shè)備。3.4 對于已復(fù)溶的鱟試劑在間歇使用過程中最好放置在冰冷的表面上或于28的冰箱內(nèi)存放24h以內(nèi);亦或在復(fù)溶并凍結(jié)后將其存放在-20以下，可存放28天，但只能凍融一次。【參考文獻(xiàn)】  1 國家藥典委員會.中國藥典.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005,二部，附錄 85-88.2 施震，尹銀嘉，李華. 特異性鱟試劑和非特異性鱟試劑對艾迪注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素檢測的比較. 中國生化藥

11、物雜志，2003，24(3)：137-138.3 梁蘋，蔡紅. 鱟試劑靈敏度對細(xì)菌內(nèi)毒素限量檢查的影響. 華西藥學(xué)雜志，1999，14(3)：204-204.4 衛(wèi)生部. 部標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑 修訂稿. WS1-364(B-123)-91.5 張紅霞, 陳慧, 馬金剛. 影響鱟試劑靈敏度測定結(jié)果因素的分析. 中國藥師，2007，10(8)：825-826.6 程義琳，吳蕙玲. 鱟試劑靈敏度對檢測結(jié)果的影響. 中國藥師，2005，8(4)：344-345.7 陳引秀. 鱟試劑靈敏度穩(wěn)定性的考察. 海峽藥學(xué)，2004，16(3)：83-84.8 金華. 鱟試劑靈敏度穩(wěn)定性觀察. 醫(yī)學(xué)理論與實踐，2004，17(1)：84-84.9 黃冬，房判石.鱟試劑法檢測細(xì)菌內(nèi)毒素假陽性原因淺析. 首都醫(yī)藥，2002，9(5)：53-54.10 中國藥品生物制品檢定所. 中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范. 北京：中國醫(yī)藥科技.11 葉良君，張強，張濤，等.-葡聚糖對含糖大輸液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的影響.中國藥業(yè)，2008，17(19)：24-25.12 黃東燕. 特異性鱟試劑檢測當(dāng)歸注射液細(xì)菌內(nèi)毒素. 中成藥，2000，22(8