1、糖尿病可引起體內各系統的合并癥    糖尿病可引起體內各系統的合并癥摘要：目的： 在糖尿病發展的不同時期探討容積依賴性氯通道蛋白-3(ClC-3)的表達及其變化。方法： 用鏈脲佐菌素(STZ)誘導大鼠糖尿病模型后,在第2、4、8、12和16周,用蛋白印記法檢測主動脈、腎臟(皮質、髓質)及腦組織上ClC-3蛋白的表達。結果： 各組織上均檢測到內源性ClC-3蛋白的表達,分子量在80 KDa-110 KDa之間;與對照組相比,糖尿病時大鼠主動脈平滑肌及腦組織上ClC-3蛋白的表達在第8周后顯著性升高(P< 0.05),腎髓質上ClC-3蛋白的表達顯著性

2、降低(P< 0.05),而腎皮質上ClC-3蛋白的表達未見顯著性差異。 結論： 除腎皮質外,在糖尿病第8周開始,ClC-3蛋白在主動脈平滑肌及腦組織上表達顯著性增加,而腎髓質表達顯著性降低。 關鍵詞：大鼠; 主動脈; 腎臟; 腦組織; 氯通道蛋白-3Abstract: Objective：This study was designed to investigate the expression and changes of ClC-3 protein under condition of diabeticrats. Methods： Diabetic rats were induced

3、by an injection of streptozotocin. At the different periods of diabetic duration (2 weeks, 4 weeks, 8 weeks, 12 weeks, and 16 weeks), the expression and changes of ClC-3 protein in thoracic aortic smooth muscle, the kidneys (cortex, medulla) and the brains were detected using Western blotting. Resul

4、ts： ClC-3 protein endogenously expressed in thoracic aortic smooth muscle, kidney (cortex, medullar) and brain of rat, and its molecular weight was between 80 ku and 110 ku. Comparing with the control group, the expression of ClC-3 was increased significantly in thoracic aortic smooth muscle and bra

5、in of diabetic rats from 8 weeks diabetic duration; however, it was decreased significantly in kidney medulla. There was no significant difference in expression of ClC-3 of kidney cortex between control and diabetic rats. Conclusion： The endogenous expression of ClC-3 protein is altered in different

6、 tissues with the development of diabetes, and it is increased in thoracic aortic smooth muscle and brain, but it is decreased in kidney medulla.Keywords: rats; aortic; kidney; brain; chloride channel protein       糖尿病患者易并發高血壓、動脈粥樣硬化、阻塞性心衰及微循環功能障礙,后者進一步引發糖尿病腎病、視網膜病、神經合并癥等,揭示

7、糖尿病本質上也是一種心血管疾病。Cl-是細胞外液的主要陰離子,通過跨膜轉運和陰離子通道蛋白參與多種生理功能,Cl-的跨膜轉運形成Cl-電流,以前當作“漏電流”而被忽視。近年來有關Cl-通道的研究得到飛速發展,其中有關容積依賴性Cl-通道的研究成為了熱點。研究發現容積依賴性Cl-通道主要由ClC-3基因編碼1,2,當細胞處于低滲條件時通道開放,繼而引起水與Cl-共同轉運出胞外,使細胞容積調節性減低。然而在糖尿病時,高血糖可引起血液滲透壓改變,容積依賴性Cl-通道發生何種變化及其與合并癥的產生是否有關是一個有趣的問題。本研究針對糖尿病時期大血管及微血管進行研究,觀察ClC-3蛋白在不同時期大鼠主動

8、脈平滑肌,腎臟及腦組織的表達及其變化。1 材料與方法    1.1   實驗材料和主要試劑      正常雄性Wistar大鼠(由中山大學實驗動物中心提供),體質量200250 g,100只。    鏈脲佐菌素(STZ)、亮肽酶、抑肽酶、疊氮鈉、二硫蘇糖醇、牛血清白蛋白(BSA)均為Sigma產品;硝酸纖維素膜為 Bio-Rad產品;ClC-3多克隆抗體為 Alomone Labs,Jerusalem,Israel 產品;羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗為Cellsignaling產品

9、;-actin 為Newmarker產品; 考馬斯亮蘭G-250 購自上海生工生物工程公司。    1.2   糖尿病大鼠模型制作    大鼠禁食12 h后一次性左下腹腔內注射由枸櫞酸鈉(0.1 mol/L,pH 4.5)配制的STZ 55 mg/kg誘導糖尿病模型。對照組注入等量溶劑。1周后尾靜脈采血,用堡靈曼血糖儀(ReflouxR,Boehringer Mannheim,德國)檢測血糖,以血糖大于16.7 mmol/L確定為糖尿病模型。分為糖尿病組和正常對照組,每組50只,每組隨機分成5個時間點,即2,4,8

10、,12和16周,每個時間點10 只動物。    1.3   組織裂解與蛋白質的提取     取不同時期Wistar大鼠的胸主動脈,腎臟皮質,髓質以及腦組織分別放入預冷的PBS緩沖液中,去除動脈周圍結締組織及血塊,用PBS沖洗3遍,加入3倍組織量的三去污劑裂解緩沖液,在冰浴下用組織勻漿器勻漿,將組織完全裂解呈乳狀后, 4 , 3 000 × g,離心5 min,留取上清,再次4 , 12 000 × g,離心2 min,取上清,置于EP管中,放入-80 冰箱保存備用(可保存1周)。  &

11、#160;  1.4   Western Blot    考馬斯亮蘭法蛋白定量后,調整蛋白量,使每個加樣孔中蛋白量相同。與5 ?滋L Marker(cellsignaling)一起進行SDS-PAGE電泳。電泳完畢后凝膠上的蛋白電轉移到硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h,與 ClC-3多克隆抗體(1 2 000)和-actin抗體(1 1 000)孵育1 h,PBST洗脫1 h。硝酸纖維素膜與HRP-結合的二抗室溫下共同孵育1 h,PBST洗脫1 h。ECL化學發光法顯示結果。膠片用凝膠成像系統掃描分析灰度。  

12、;  1.5   統計分析    結果均采用x±s表示,n代表動物數,同時期組間和同組的差異分別采用組間和配對t檢驗,檢驗標準取=0.05。2 結果    Wistar大鼠腹腔注射STZ建模成功后,糖尿病組出現明顯的多飲、多食、多尿及生長遲緩等癥狀。糖尿病組血糖(27.3 ± 2.3)mmol/L,明顯高于正常組(5.2 ± 0.5)mmol/L;體質量(232 ± 26)g,明顯低于正常組(277 ± 27)g;差異有統計學意義(P< 0.01),

13、 整個實驗期間糖尿病組血糖均高于正常組,體質重均低于正常組。    2.1   ClC-3蛋白在大鼠主動脈平滑肌中的表達    糖尿病大鼠主動脈平滑肌上ClC-3蛋白的表達升高,在第8周和12周時表達與對照組有顯著性差異(P< 0.05,圖1)。    2.2   ClC-3蛋白在大鼠腎臟皮質中的表達    糖尿病大鼠腎臟皮質上ClC-3蛋白的表達在第2周到12周時有升高的趨勢,在第16周時有降低的趨勢,但未見統計學差異(圖2)。

14、    2.3   ClC-3蛋白在大鼠腎臟髓質中的表達    糖尿病大鼠髓質上ClC-3蛋白的表達在第2周到16周時有降低的趨勢,在第12周和16周時與對照組相比有顯著性差異(P< 0.05, 圖3)。    2.4   ClC-3蛋白在大鼠腦組織中的表達    糖尿病大鼠腦組織上ClC-3蛋白的表達升高,在第12周和16周時表達與對照組有顯著性差異(P< 0.05, 圖4)。3 討論   

15、糖尿病可引起體內各系統的合并癥。 大量研究表明與合并癥產生有關的主要是由高血糖引起的:非酶類糖化過程、氧化還原應激、醛糖還原酶激活和二酰基甘油(DAG)-蛋白激酶C(PKC)通路激活這四大因素 1。    Cl-是細胞外液中最為豐富的陰離子,氯通道普遍存在于真核細胞的細胞膜和細胞器膜。細胞容積的穩態十分重要,細胞內外滲透壓變化、細胞生長分裂等可引起細胞容積發生改變,而在細胞容積調節中Cl-通道起重要作用。多項研究提示ClC-3蛋白是容積激活(volume-activated)Cl-通道,參與許多生理功能。編碼ClC-3蛋白的基因已從大鼠腎3、小鼠肝、人胎腦4、豚鼠

16、心臟5等組織克隆。有研究表明細胞內PKC是ClC-3通道的內源性抑制劑,PKC抑制作用的去除與低滲引起的通道開放密切相關6。    本實驗結果表明糖尿病大鼠主動脈平滑肌,腎臟皮質及腦組織上ClC-3蛋白的表達在糖尿病不同時期基本均升高,與糖尿病時PKC活性增強,而PKC又可以抑制容積調節性Cl-通道的表達的推測不符。其可能原因是:與氧化應激有關。有研究表明在糖尿病大鼠眼睛白內障發生的過程中,其晶狀體皮質纖維細胞中ClC-3蛋白及mRNA 的表達升高,用抗氧化劑干預后可使其降低7。同時由氧化應激誘導上升的ClC-3表達具有保護細胞凋亡的作用8,9。與炎性因子有關。有

17、研究顯示炎性因子可刺激ClC-3的表達增加10。在糖尿病中高血糖可促進多種血管活性物質和細胞因子的表達,如Ang、ET-1、NO、NOS、VEGF和TNF-等11。與離子通道重構有關。有研究表明在腹主動脈狹窄的動物模型中,在狹窄術后早期,ClC-3蛋白的mRNA的表達升高,血壓降低可以保護心肌離子通道的重構而不使ClC-3的表達增加。    糖尿病大鼠腎臟髓質中ClC-3蛋白的表達下降,可能原因是:血管通透性的增加。糖尿病腎小球高濾過是早期DN的一個重要特征。腎臟髓質的生理功能主要是重吸收,高濾過及蛋白尿導致髓質重吸收功能下降。而Cl-通道是重吸收機制中的重要離子

18、通道組成部分之一。與糖基化反應有關。在糖尿病中普遍存在糖基化反應,細胞外糖基化終末產物可能干擾細胞黏附和細胞間反應,細胞內糖基化終末產物能夠改變蛋白轉運和功能。    高糖作為糖尿病合并癥產生的始動因素引起體內糖基化產物生成,氧化應激增加,多種血管活性物質及炎性因子產生,血流動力學改變等一系列變化12。在糖尿病過程中ClC-3蛋白受以上因素影響,表達發生變化,至于ClC-3蛋白改變是加重并發癥的產生,還是一種保護性變化,還有待我們進一步探討。總之,本研究結果表明,容積激活的Cl-通道在糖尿病的不同組織發生了不同的變化,可能參與了糖尿病合并癥的產生。參考文獻

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