1、    腫瘤抗原負載DC激活的CTL對裸鼠移植瘤作用的研究作者：王雪峰1 ， 張莉2，杜曉媛3 ，梁雯1 ，遠洋1 作者單位：(1.遼寧醫學院附屬第一醫院耳鼻咽喉頭頸外科;2.遼寧醫學院組織胚胎學教研室;3.遼寧醫學院附屬第一醫院病理科，遼寧 錦州 121000)【摘要】 目的 研究負載人喉癌細胞系Hep-2凍融抗原的樹突狀細胞(DC)體外活化的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)在裸鼠Hep-2移植瘤發生、發展中的作用。方法 以健康人外周血貼壁單核細胞體外誘導DC并負載Hep-2凍融抗原，經MTT法檢測其激活的同基因型T淋巴細胞在體外對Hep-2的殺傷活性后，

2、將此Hep-2特異性CTL預防性接種于裸鼠皮下(預防組6 只，對照組16 只),3 天后接種Hep-2，觀察其移植瘤的發生率：再將此CTL分以1 次、2 次治療性接種于已荷瘤裸鼠皮下(對照組6 只;治療組和加強治療組各5 只)，觀察移植瘤的生長情況。結果 預防組Hep-2移植瘤的發生率明顯低于對照組(預防組33%，對照組00%，P=0.0002);治療組與加強治療組裸鼠荷瘤體積明顯小于對照組(P<0.05，P<0.01)，且加強治療組裸鼠荷瘤體積明顯小于治療組 (P<0.05)。結論 負載Hep-2凍融抗原的DC活化的CTL不僅能預防裸鼠Hep-2移植瘤發生而且能抑制其移植瘤

3、的生長。【關鍵詞】 樹突狀細胞;腫瘤免疫治療;喉癌;裸鼠The Study of the Effect of Cytotoxic T Lymphocyte Activated in Vitro by DendriticCell Loaded with Tumor Antigens on the Implanted Tumor in Nude MiceWANG Xuefeng1， ZHANG Li2， DU Xiaoyuan3， LIANG Wen1， YUAN Yang1(1.Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery of the F

4、irst Affiliated Hospital， Liaoning Medical University;2. Organization Embryology Department of Liaoning Medical University;3. Pathology Department of the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University， Jinzhou 121000 China)Abstract： Objective To study the effect of the cytotoxic T lymphocy

5、te (CTL)activated by dendritic cell (DC) loaded with human laryngeal carcinoma cell line Hep-2 lysates on the Hep-2 implanted tumor occurrence and its growth in nude mice.Methods In vitro DC was induced by monocyte isolated from human peripheral blood mononuclear cells and loaded with antigens from

6、Hep-2 tumor lysates. Also in vitro the efficacy of killing Hep-2 cell with Allogeneic T lymphocyte activated by DC was examined through MTT. In vivo the tumor occurrence rate of nude mice previously subcutaneously injected the specific CTL (6 from precaution group， 16 from control group) and its gro

7、wth among the 16 Hep-2 implanted tumor nude mice treated by specific CTL once or twice were observed (6 from control group， 5 from treatment group and 5 from retreatment group respectively). Results Within 20 days the tumor occurrence of the precaution group was significantly reduced compared to tha

8、t of the control group (p-0.0002); the Hep-2implanted tumor size of the treated and retreated group were significantly inhibited (P<0.05，P<0.01) compared with the control group， and the retreated was more significantly than the treated (P<0.05).Conclusions The CTL activated by DC loaded wit

9、h antigens from Hep-2 lysates can not only protect the nude mice against the challenge of Hep-2 cell but also inhibit the growth of the Hep-2 implanted tumor in nude mice.Key words：dendritic cell; tumor immunity; laryngeal carcinoma; nude mice樹突狀細胞(dendritic cell，DC)是目前已知功能最強的專職抗原提呈細胞(antigen presen

10、ting cell，APC)，它因能刺激并致敏初始T細胞和啟動早期免疫反應而在腫瘤免疫治療中占有重要的地位。國內、外已有實驗應用DC疫苗治療一些惡性腫瘤并獲得初步肯定，但在治療喉癌方面尚未見有報導。本實驗研究以Hep-2抗原負載的DC在體外激活同基因型T淋巴細胞產生的特異性CTL，能否直接在體內預防裸鼠Hep-2移植瘤的發生和抑制其移植瘤的生長，為進一步探討DC疫苗用于臨床治療喉癌提供實驗依據。1 材料與方法1.1 實驗動物與細胞裸鼠BALB/C22只，雌性，46周齡，(20±2)g，購于中國醫科大學SPF級動物實驗中心。人喉癌細胞系Hep-2購自北京耳鼻咽喉研究所;健康人新鮮外周血

11、購自錦州市中心血站。1.2 主要試劑及儀器完全培養基：RPMI-1640(GIBCO公司)、20%胎牛血清(FBS)、2 mmol/L谷氨酰胺、20 mmol/L HEPE是(SIGMA公司)、l mmol/L丙酮酸納、100 U/mL青霉素、80 U/mL慶大霉素：rhGM-CSF(華北制藥廠)，rhIL-4、rhIL-2 (BIO公司)，rhTNF-(EC公司);淋巴細胞分離液(天津)，尼龍毛 (上海);四氮唑藍鹽(MTT)(華美生物公司);小鼠抗人CD83McAb(深圳裕盛佳公司)，S-P免疫細胞化學染色試劑盒(邁新生物公司)。WJ-6C。二氧化碳孵育箱(日本)，DG3022A型酶聯免疫

12、檢測儀(華東電子管廠)。1.3 腫瘤細胞凍融抗原的制備收集處于對數生長期的Hep-2腫瘤細胞，用生理鹽水洗2 次，制成濃度2×108/mL，反復凍融(-70 /37 )4 次，2 000 r/min離心1 h取上清，過濾除菌，4 保存備用。1.4 DC的誘導與鑒定取健康人新鮮外周抗凝血，用Fic。11不連續密度梯度離心法分離獲得單個核細胞，低滲裂解紅細胞，PBS洗去血小板，以含20%FBS的RPMIl640調整細胞濃度至1×107/mL，取5 mL加入T-25塑料培養瓶，37 ，5%CO2孵箱培養2 h后，吸除未貼壁細胞即獲貼壁單核細胞，加入完全培養基、rhGM-CSF 1

13、 000 U/mL、rhIL-4 1 000 U/mL常規培養，每2 d換液1 次。第四天將細胞分為2 組：負載組另加Hep-2凍融抗原5×106/mL (抗原量以凍融前Hep-2細胞數計)、rhTNF-200 U/mL;未負載組不加凍融抗原，繼續培養4 d，收集懸浮細胞，部分用完全培養基重懸浮備用：余用小鼠抗人CD83McAb以S-P免疫細胞化學染色法鑒定。1.5 CTL的體外誘導及活性檢測取與DC來源相同的新鮮外周抗凝血，同上法用含20%FBS的RPMIl640調整單個核細胞濃度小于1×108/mL，注入自制的T細胞尼龍毛柱，37 溫育1 h后用上述培養基沖洗出非粘附細

14、胞即為T淋巴細胞;將其分與兩組DC按10：1的比例混合，加含IL-2 1 000U/mL的完全培養基，37 ，5%CO2孵箱培養72 h，分收集細胞(CTL)。用含10%FBS的RPMI-1640重懸細胞，將各效應細胞(負載組的特異性CTL、未負載組的非特異性CTL和單純T細胞，5×104/孔)與靶細胞(處于對數生長期的Hep-2細胞5×103/孔)按效靶比10：1混合，置于96 孔平底培養板中(0.2 mL/孔);同時分設效應細胞(5×104/孔)與靶細胞(5×103/孔)平行對照孔(0.2 mL/孔)，每組復設5 孔，37 ，5%CO2孵箱培養72

15、h后，加入5 mg/mLMTT溶液0.2 mL繼續培養4 h，離心沉淀、去上清、無水乙醇溶解，用酶聯免疫檢測儀在波長570 nm測各孔光密度值(OD)，計算效應細胞對靶細胞的殺傷率：殺傷率二(靶細胞OD值+效應細胞OD值效靶細胞殺傷反應后OD值)/靶細胞OD值×100%。1.6 制備接種液分取處于對數生長期的Hep-2細胞和Hep-2抗原特異性CTL，PBS (pH7.2)洗2 次(1 000 rpm/min)再重懸，經臺盼藍拒染法檢測細胞活性均大于95%，PBS調整細胞濃度5×106/mL。1.7 預防裸鼠Hep-2移植瘤的發生將22只裸鼠隨機分組：預防組(6 只)于裸鼠

16、右側背部皮下接種0.2 mL特異性CTL(1×106)，對照組(16只)以0.2 mL生理鹽水作對照：3天后于兩組裸鼠左側背部皮下接種0.2 mL Hep-2(1×106)，每天觀察1 次其移植瘤發生情況，直到接種Hep-2后第20 d，處死預防組裸鼠。1.8 抑制裸鼠Hep-2移植瘤的生長將上述成瘤后的對照組隨機分成3組：治療組(5 只)在第18 天于右側背部皮下接種0.2 mL特異性CTL作治療，加強治療組(5 只)在第18、24 d 2 次作上述治療，對照組(6 只)在第18、24 d注射0.2 mL生理鹽水作對照;每天觀察1 次其移植瘤生長情況，直到第39天處死裸鼠

17、，記錄腫瘤正交直徑(mm)，計算其體積(mm3)=長×寬2/2。1.9 統計學方法兩組間的計量資料比較采用t檢驗，在三組間比較用單因素方差分析及q檢驗。計數資料采用四格表確切概率法。實驗所得數據均以-(-所)±s表示，P<0.05具有統計學意義。2 結 果2.1 鑒定成熟DC人外周血貼壁單核細胞體外誘導7 d，抗原負載與未負載組的DC在形態上無明顯區別，大部分懸浮生長，具有樹突狀突起呈毛刺狀、星狀、蝌蚪狀、梭形等(圖2)，經S-P免疫法鑒定，CD83+陽性率均達80%以上(圖3)，顯示已分化成熟。2.2 MTT法檢測特異性CTL殺傷活性2.3 特異性CTL預防裸鼠He

18、p-2移植瘤的發生預防組裸鼠接種Hep-2細胞后20 d內有2 只發生移植瘤，其發生率為33%：而對照組裸鼠于接種后8 天內即有移植瘤發生，14 d內16 只均發生移植瘤，其發生率為100%，預防組移植瘤發生率明顯降低 (P=0.0002)。2.4 特異性CTL抑制裸鼠Hep-2移植瘤的生長3 討 論宿主對腫瘤的排斥依賴于高效而特異的抗腫瘤免疫反應，尤其是T細胞免疫，而在荷瘤宿主體內由于APC功能存在缺陷，特別是DC的數量、功能和形態學的改變可使DC表面分子表達抑制和DC功能發生缺陷，甚或有些腫瘤引起DC凋亡，從而阻斷了T細胞特異性抗腫瘤反應的發生。研究表明，負載腫瘤抗原的DCs能協調腫瘤抗原

19、，在體內、外有效地誘導T淋巴細胞介導的抗腫瘤作用，可使T細胞增殖、活化，通過活化因子的作用，產生高效、特異性殺傷腫瘤細胞的CTL，從而抑制腫瘤的發生與發展。目前，研究者多以DC疫苗的制備，進行免疫疫苗的實驗，以嘗試免疫治療的研究。張莉等就用健康人外周血貼壁單核細胞體外誘導出功能正常的DC，并以負載喉癌(Hep-2)細胞凍融抗原的DC在體外誘導出高效而特異的抗喉癌免疫，本實驗利用BALB/C裸鼠T淋巴細胞免疫缺陷的特性，進一步觀察誘導出的特異性CTL在裸鼠體內的抗喉癌移植瘤效應，為臨床應用DC疫苗免疫治療喉癌及預防腫瘤復發提供理論實驗依據。實驗中，裸鼠因預防性的輸入了特異性CTL，預防組20天內

20、移植瘤的發生率明顯低于對照組(P=0.0002)，提示機體在沒有T細胞免疫監視時易于發生腫瘤，而經Hep-2抗原負載DC誘導的特異性CTL可明顯抵抗Hep-2細胞對裸鼠的攻擊，預防Hep-2移植瘤的發生。對已荷瘤裸鼠，治療組與加強治療在輸入特異性CTL后，移植瘤的生長受到明顯抑制，且加強治療組受到的抑制比治療組更明顯;生長曲線進一步顯示，在治療組經一次CTL治療后，這種抑制作用持續約1 w就逐漸減弱，而在加強治療組，由于及時補充有效劑量的CTL這種抑制作用持續的時間延長，減弱趨勢延緩。這與輸入到裸鼠體內的腫瘤抗原特異性CTL主要通過程序性死亡和滲透性致死的殺傷機制來抑制腫瘤的發生與生長有關。在

21、此過程中CTL自身并無損傷，可繼續殺傷瘤細胞，但CTL在裸鼠體內有一定的生存期且無繼續增殖的條件，故其在裸鼠體內是逐步衰減的。綜上分析說明，要取得較好的抑制腫瘤生長的效應最終需要的是抗原特異性CTL和其有效劑量的維持，從而進一步證實負載腫瘤抗原的DC能有效地啟動T細胞以抗原特異的形式識別和殺傷腫瘤細胞，抑制腫瘤的發生與生長。在喉癌患者體內有豐富的T淋巴細胞，包括處于非激活狀態的腫瘤浸潤性T淋巴細胞，設想應用負載喉癌抗原的DC疫苗就能在體內誘導出類似于體外產生抗原特異性CTL的主動免疫反應，將喉癌抗原有效地提呈給體內T淋巴細胞并使其大量增殖活化，從而發揮高效而特異的抗喉癌免疫，達到腫瘤免疫治療的

22、效果。盡管腫瘤患者體內T細胞缺陷或受到抑制致使功能低下，使TCL功能下調，但是，如果通過基因修飾、活化細胞因子等構建新型融合疫苗，通過不同途徑激活T淋巴細胞，誘導產生的TCL的活性大大提高，增強了免疫殺傷作用，這將為喉癌患者免疫治療提供了新的思路，具有很好潛在的臨床應用價值。【參考文獻】Melief CJ. Cancer immunotherapy by dendritic cells. Immunity,2008， 29(3)： 372-383.Gerner MY， Mescher MF. Antigen processing and MHC-II presentation by dermal and tumor-infiltrating dendritic cells . J Immunol,2009， 182(5)：2726-2737.Pirtskhalaishvili G， Shurin GV， Gambotto A， et al.Transduction of dentritic cells with Bcl-XL increase their resistance to prostate cancer-induced apoptosis and ant itumor effect in mice. J