1、DOC格式論文，方便您的復制修改刪減電針與電針合并氟西汀治療抑郁癥的基因譜表達異同的研究（作者:單位:郵編:【摘要】目的研究電針和針藥結合治療抑郁癥作用的機理，通過兩者基因譜表達的異同以了解針藥結合的優缺點，為臨床應用電 針和針藥結合治療抑郁癥提供實驗依據。方法取正常組、模型組、電針 組、針藥組（電針合并氟西汀灌胃）大鼠的海馬組織進行RocheNimbleGen全基因組表達譜芯片測試并進行數據分析。結果電針組它U偏''的基因有226條;針藥組“糾偏'的基因有221條，討曾偏的基因（與正常組的差異更甚于模型組）有9條。兩組“糾偏的基因均 以下調的基因為主，涉及凝血、炎癥和

2、凋亡相關基因等，其中電針組 為125條，針藥組為157條;而上調的基因包括蛋白質生物合成有關的基因、嗅覺感受器和微管系統基因等，其中電針組為101條，針藥組為64條。結論電針與針藥治療抑郁癥的機理與改善多條基因的 表達有關，兩者的差異表達基因譜較為相似;針藥結合的優勢體現在強有效地下調凝血因子V和5輕色胺2C受體的表達。同時針藥結合 的 結果還出現'澹偏基因，可能是由于氟西汀的副作用引起的【關鍵詞】電針；針藥結合；抑郁癥；基因芯片 近十年來，有大量報道運用電針或電針合并氟西汀治療抑郁癥的臨床及實驗研究。通過臨床觀察對比，電針或針藥結合比口服氟西汀 起效快，電針在快速起效中起了主要作用;

3、而針藥結合又能減輕氟西汀的不良反應，較氟西汀、單純電針療效更確切，可縮短病程，是一種安全、有前途的聯合治療方法1 0但在動物實驗研究24中并未反映針藥結合比單純電針具有更好的療效，或者針藥結合比單純電針具有更多不良反應。為了深入了解針藥結合的優勢及其不足之處，我 們對運用電針和電針合并氟西汀治療的抑郁癥大鼠進行全基因組表達譜芯 片測試并進行數據分析，尋找兩者基因譜表達的異同，以了解 針藥結合的 優缺點；亦從基因表達的層次討論兩者治療抑郁癥的機 理。1材料與儀器 11動物SD清潔級大鼠，體質量220-260 g,雄性，由浙江 省實驗動物中心提供，合格證號：SCXK （浙）2008 : 0033o

4、12儀器和試劑Morris迷宮（淮北正華生物儀器設備有限公司產品，型號:MORRIS） ;HANS 200B型韓氏穴位神經刺激儀（南京濟生醫療科技有限公司生產）；NanodropND JOOO微量紫外/可見分光光度計（美國Na noDrop科技有限責任公司）；MAUI Hybridizati on System生物芯片雜交儀（美國 BioMicro Systems） ;Genepix4000B Scanner 芯片掃描 儀（美國 Axon 公司）。Trizol （美國 invitrogen 公司）,RNeasy kit（RNA提取試劑盒）（德國Qiagen公司）;Cy3 4弭朵類菁染料）等。2

5、方法 2.1分組大鼠經適應性飼養1周后用OpeField法作行為學測 試。實驗中所用“敞箱以morris迷宮代之。用該系統記錄大鼠在3 min內的水平活動軌跡并計算相應的路程，以反映大鼠的活躍程度或抑郁 狀態，比通常所用敞箱數方格的方法準確。為了盡可能降低實驗數據的離散度，經反復實驗，選取水平路程在（2 7003 500 cm）的正常 大鼠進行實驗。另以大鼠兩只前肢離地直立次數為垂直活動得分，反映其對外界的好奇心和探究心理。由于直立次數在個體間的差異較小，一般按水平路程的測試結果進行評價。將水平路程相近的40只大鼠隨機分為正常組、模型組、電針組、針藥組，共 4組，每組10只;正常組每籠飼養5只

6、，其余各組每籠1只（置小籠中孤養）。22造模模型組、電針組、針藥組大鼠，共接受21 d各種不同的應激，包括冰水游泳（4C，5min）、熱應激（45 C水浴，5 min） v禁 水（24 h） V夾尾（1 min） v電擊足底（電壓50 mV,每隔15 5朿1激1次每次持續10 S，共15次）、搖晃（1次/S, 5 min） v禁食（24 h）和晝夜顛倒等刺激，每天隨機給予12個刺激，相同的刺激不連續出現，每種刺激總共不少于4次。正常組大鼠不接受應激，并飼養在另一間房間以免受影響。23治療（造模結束行為學測試后立即介入治療）正常組:繼續常規飼養，每籠飼養5只;模型組：繼續孤養，不予任何治療措施;

7、電針組=繼續孤養，電針治療。治療時操作者采取坐姿，彎膝，兩腿間鋪 以隔水的塑膠，取一廢枕頭套置其上，大鼠自籠中取出后令其趁勢鉆進枕頭套中，遮蔽其雙眼并用手固定其頭部。選擇百會、印堂穴=根 據實驗針灸學大鼠穴位圖譜選百會穴，并依據比較解剖學，在大鼠前正中線與額頂骨縫交界線前方處定印堂穴。選用蘇州醫療用品廠生產的華佗牌.35X13 mm針刺針進行治療。針刺方法：百會穴、印堂穴均向前（鼻側）平刺4 mm,分別接韓氏穴位神經刺激儀的正負極，頻率2Hz,輸出電流1 mA,刺激時程15 min/次，1次/d。在施 針過 程中保持安靜，避免驚嚇大鼠，減少額外刺激。針藥組=按照1.8 mgkg_1給予氟西汀灌

8、胃后30 min施以電針。由于大鼠的生活規 律為晝伏夜出，為了不干擾其白天休息，特意在20: 00 24 : 00 進行治療。分別于造模前（dO）、造模結束（d21）及治療一周后（d28）測 定 各組大鼠的體質量、行為學（水平運動和垂直運動）和糖水消耗量。24取材治療1周后處死各組大鼠，開顱取腦，在冰盒上分離 海馬，置液氮中保存。正常組、模型組、電針組、針藥組大鼠各取 個標本送交上?？党缮锕こ逃邢薰具M行 Roche NimbleGen全基因組表達譜芯片測試以及real timePCR驗證，芯片名稱為Rattus norvegicus 12 x135Karray。2.5全基因組表達譜芯片主要

9、實驗流程 251總RNA的抽提及質量檢測取正常組、模型組、電針組、針藥組大鼠海馬組織各100 mg,用Trizol和RNeasy kit抽提RNA,使用Nanodrop測定RNA在260 nm、280 nm和230 nm的吸收值，以計算濃度并評估純度。用甲醛電泳試劑進行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA純度及完整性。2.5.2 cDNA樣品合成和標記取1總RNA,反轉錄成cDNA并用Cy3標記。2.5.3標記效率質量檢測使用Nanodrop檢測熒光標記效率，保證后續實驗的可靠性。2.5.4芯片雜交在標準條件下將標記好的探針和高密度基因組 芯片在雜交盒中65 C滾動雜交17 m依次用相應的洗滌液洗滌

10、芯片，室溫晾干。255圖象掃描及數據處理用Genepix4000B Scanner掃描芯 片，以 NimbleScan software (version 2,5, Roche )讀取原始數據(rawintensity),并進行背景值修正和分位數標準化處理(Normalized ),將標準化后的數據導入Genespring GX (Agilent version 10.0),比較 兩組 樣品之間 Normalized 值，計算 Fold changeo2.6判定標準fold change瑩的基因為表達顯著上調基因，Foldchange 0,5為表達顯著下調基因。3結果(由于篇幅所限，本文未列出

11、大鼠體重、行為學和糖水消耗量的數據，電針組和針藥組對上述指標均有改善趨勢3.1散點圖所有基因在兩組樣品中的表達差異可用散點圖表 示。其中X軸和丫軸分別以2個樣品的熒光信號強度值為坐標，圖中每一個數據點代表芯片上一個基因的雜交信號，絕大多數無差異表達信號位于3條平行線之間，差異表達信號為平行線之外的數據點。左圖中平行線以外左側數據點為模型組VS正常組上調表達的基因, 右側數據點為模型組VS正常組下調表達的基因；中圖中平行線以外 左側 數據點為電針組VS模型組上調表達的基因，右側數據點為電針 組VS模型組下調表達的基因；右圖中平行線以外左側數據點為針藥組VS模型組上調表達的基因，右側數據點為針藥組

12、VS模型組下調表達的基因。chip2為正常組，modell,為模型組，chip7為電針組，chip9為針藥組圖1散點圖3.2聚類圖聚類圖是按照層次聚類(hierarchical)的分析方法，根據樣本表達譜的相似性將樣本劃分為不同的組別，以反映各組基因表達的親遠關系。從圖2可知，正常組和模型組分據兩端，關系最遠；電針 組和針藥組居于中間，其中電針組距離正常組更近些，表明電針 組基因 譜的表達與正常組更為相似。chip2為正常組，modell為模型組，chip?為電針組，chip9為針藥組。采用Chip2 vs Modell, Chip? vs ModeH和Chip9 vs Modell 差異基因

13、的交集對 Chip2, Chip?, Chip9 及 Modell 四 個樣本作聚類圖2聚類圖3.3差異表達基因譜根據基因芯片的熒光強度而獲得的差異表 達基因，是分別將模型組VS正常組、電針組VS模型組、針藥組VS模型組進 行比較的結果。其中模型組VS正常組的差異表達基因668條，下調267 條，上調401條;電針組VS模型組的差異表達基因1482條，下調416條, 上調1 066條;針藥組VS模型組的差異表達基因1 276條，下調444條,上調832條。我們所考慮的是電針及針藥結 合療法通過調控哪些基因以治 療抑郁癥，所尋找的是能反映疾病本質的基因，而電針組VS模型組及針 藥組VS模型組的差

14、異表達基因過 于寬泛，必須將兩者與模型組VS正常組的差異表達基因進行比較，才能 找出真正的目標基因。通過上述比較，我們得到兩個交集: 針組VS模型組）VS （模型組VS正常組）226條基因；（針藥組VS模型 組）VS （模型組VS正常組）230條基因。這兩個交集中又因上調下調的 不同而各自分出兩個子集。前者226條基因中，模型組VS正常組表 達下 調的基因，恰恰是電針組VS模型組表達上調的基因；而模型組VS正常組表達上調的基因正好是電針組VS模型組表達下調的基因。換言之，電針組糾正因造模導致的基因表達的偏差（當然，是部分糾正）。后者230條基因中絕大部分與電針組類似，為“糾偏的基因，但 也有個

15、別基因是'吐曾偏，'的，即上調、下調的趨勢與模型組相同，而 且信 號比值（fold, change）大于模型組，其與正常組的差異更甚于模 型組。以下表12為上述電針組和針藥組“糾偏的基因，并對其進 行功能分 類。331抑郁癥模型大鼠下調表達的，經電針及針藥治療后表達趨于正常的基因見表1。332抑郁癥模型大鼠上調表達的，經電針及針藥治療后表達趨于正常的基因見表2。表1抑郁癥模型大鼠下調表達的，經電針及 針藥治療后表達趨于正常的基因表2抑郁癥模型大鼠上調表達的，經電針及針藥治療后表達趨于正常的基因3.3.3小結針藥組與抑郁癥治療相關的差異表達基因譜類似于電針組，亦有差異。電針組糾偏

16、"的基因有226條;針藥組“糾偏的基因 有221條，“增偏的基因有條。兩組“糾偏的基因均以下調的基因為 主，可以分為凝血、免疫、炎癥、凋亡、信號轉導、蛋白質降解等 幾個類 別，電針組有125條，針藥組有157條。其中，對于信號轉 導、運動、攝 食和睡眠等功能的調節，針藥組優于電針組，而對于凋 亡的調節，電針組 則優于針藥組。而上調的基因中，可以分為能量和 物質代謝、蛋白質生物 合成、嗅覺感受器、微管系統、轉錄調節等幾 個類別，電針組有101條, 針藥組有64條。其中，對于能量代謝、蛋白質生物合成、抗氧化應激損 傷等基因的調節，電針組優于針藥組。此外，針藥組出現某些'吐曾偏的

17、基因，電針組則未出現。4討論 4.1電針組與針藥組“糾偏基因的生物學功能4.1.1抑郁癥模型大鼠下調表達的，經治療后表達增高的基因（只討論其中一部分）與蛋白質生物合成有關的基因（如I ribosomalprotein）：核糖體蛋白（ribosomal protein）是核糖體的重要組成部分，在蛋白質合成過程中起重要的作用，例如對核糖體的空間構象進行調整，形成有 功能的三維結構；在核糖體的結合位點上協同rRNA催化 蛋白質的合成,核糖體蛋白基因在抑郁模型大鼠腦中表達下降，意味著蛋白質生物合成可能出現障礙，繼而將導致相應的生物學功能的降低，出現抑郁癥 狀；而經電針及針藥治療后這類基因表達增加，有利

18、于蛋白質生物合成的 順利進行，調節相應的生物學功能，減輕抑郁癥狀。嗅覺感受器基因(olfactory receptor)：大腦負責嗅覺和情緒的區 域杏仁外側核、邊緣系統甚至下丘腦等有重疊和交叉，其功能相互聯 系和相互影響。臨床發現，重度抑郁癥患者可能損害嗅覺功能，其嗅 覺敏 感度低于正常人6。嗅覺系統的感受器一旦破壞，嗅覺傳入通路中 斷，嗅覺中樞興奮來源喪失，腦中樞反饋通路中斷，神經遞質紊亂，而引 起抑郁癥。同時，嗅覺感受器損傷導致多巴胺受體感覺神經元缺 失，使嗅球區多巴胺分泌減少，也是導致抑郁癥的可能因素7。抑郁模型大鼠腦中嗅覺感受器基因的表達普遍下降,是其抑郁癥狀的反映經電針及針藥治療后此

19、類基因表達趨于正常，正是其療效的體現。與能量代謝有關的基因（cytochrome c oxidase subunit Vic細胞色素C氧化酶Vic亞基):為電針組所獨有。細胞色素C氧化酶 在細胞呼吸中處于細胞色素系統的末端，接受來自4個細胞色素C的4個電子，并傳遞到一個氧氣分子上，結合來自基質內的4個質子來制 造水分子，同時跨膜轉運4個質子，形成跨膜的質子電化學勢能差，該勢能差可用于制造ATPo細胞色素氧化酶是由多個亞基和輔因子組成的，必須要通過組裝才能形成完整的活性分子。細胞色素氧化酶亞基在抑郁模型大鼠腦中表達下降，表明其能量代謝受抑制,ATP生成減少;而大鼠經電針治療后該基因表達增加，從而

20、增加ATP的生成，有利于細胞功能的發揮。4.1.2抑郁癥模型大鼠上調表達的，經治療后表達降低的基因（只討論其中一部分）與凝血相關的基因=凝血因子V基因在抑郁癥模型大鼠的表達比正常組增加了 234倍，顯示該基因在抑郁癥發生發展過程中意義不同尋常。活化的凝血因子V （FVa）的作用為FVq、FXa、鈣離子及磷 脂（細胞膜）共同構成凝血酶原復合物，參與凝血酶原的活化，顯著提 高凝 血酶原的活化速率8-10 0凝血因子V急劇增多其后果可能導致 血液 凝固性增加而使血流緩慢，局部腦血流灌注降低。與模型組比較，電針組的凝血因子V下調了 21倍，而針藥組下 調了 25倍，遠低于電針組，甚至低于正常組（但與正

21、常組無顯著性差異）。提示電針和針藥對于大腦均有活血通絡作用，幫助機體恢復正常的 新陳代謝，以減輕抑郁癥狀；而針藥的作用遠遠強于單純電針，可能是電 針與藥物（氟西?。﹨f同作用的結果。與炎癥相關的基因（如 phospholipase A2 , group V , sPLA2V,磷脂酶A2V亞基）：sPLA2 V為針藥組獨有，屬分泌型磷脂酶A2,集中分布于大腦皮層和海馬11, 12,在急、慢性炎癥反應中，PLA2活性均增高并介導一系列病理生理過程，在許多炎癥介質和細胞因子的表達激 活的網絡調節中起著'，扳機樣'，作用。SPLA2V能促進白細胞 三烯C4和前列腺素E2的生成13,在急性

22、炎癥反應中，SPLA2V在調控類花生四烯酸物質反應中對免疫系統也產生調控作用14 0SPLA2V的表達顯著增加，表明抑郁癥模型大鼠的炎癥反應加劇，將導致一些細胞結構損傷和功能下降；經針藥治療后基因表 達趨于正常，在一定程度上減輕免疫和炎癥反應，對抑郁癥狀的緩解不 無益處。另外，電針組下調Toll樣受體（TLR） 3,從另一方面 改善抑郁 癥模型大鼠的免疫和炎癥反應，則是電針組所特有的。與凋亡相關的基因（如Death receptors,死亡受體5）：死亡受 體5 （DR5）,是在TRAIL （腫瘤壞死因子相關調亡誘導配體）誘導細胞 凋亡過程中起主要作用的受體，具有胞漿死亡結構域，與 TRAIL

23、特異性結合后可通過死亡結構域激發和傳遞死亡信號，激活caspase蛋白酶解級聯反應，導致細胞死亡。除了引起腫瘤細胞凋亡以外，也和胸 腺細胞和神經細胞的死亡有關15, 16 O有報道凋亡參與應激導致神經元損傷。Lucassen發現重癥抑郁 患者在視皮質、海馬下腳、齒狀回及CA1s CA4區有神經細胞的凋亡17,以及慢性心理應激大鼠海馬神經元減少18 0 DR5等基因在抑郁癥模型大鼠海馬中表達增加，加劇細胞凋亡。電針組和針藥組均 下調DR5的表達，這對于神經細胞存活和維持相應的生理功能具有重要的意義。與減少運動和攝食有關的基因(5 hydroxytryptami nereceptor 2C, 5

24、輕色胺2C受體）為針藥組獨有。5 輕色胺2C受體是5 一輕色胺受體家族中的一個亞型，屬G蛋白偶聯受體，具有減少運動和攝食的功能19。研究表明，主要情感失常性疾病的發病機制與2C受體的基因多態性有一定的關聯20 0激活下丘腦和邊緣葉結構的5輕色胺2C受體將導致欲望和覺醒的降低21, 22 0在抑郁癥模型孤養將導致5 HT2C受體的敏感性增強，而后者在動物焦慮癥/抑郁癥模型中可能促進動物對應激的反應以及對新事物的恐懼23 0精神患者和正常人服用5 C HT2C受體激動劑m chloro phenylpiperazine （mCPP）后興奮5HT2C受體，表現出一系列焦慮癥狀24；而5羥色 胺2C受

25、體的抑制劑S32006對多種抑郁模型均顯示良好的抗抑郁和抗焦慮作用25。深入的研究表明：5輕色胺2C受體可以促進GABA的釋 放，而后者可通過GABA A和B受體抑制5HT的釋放2631。以上研究有力地證明了 5輕色胺2C受體與抑郁癥發生的密切關系。單純電針組對5輕色胺2C受體的表達下調倍數為1.524,無顯著性差異，而針藥組為2.63,明顯下調其表達，使運動和攝食增力口，這是針藥 結合治療抑郁癥的優勢的體現，是針藥協同作用的結果。42針藥組''增偏基因的生物學功能lipopolysaccharidebinding protein （LBP,脂多糖結合蛋白）等9條基 因上調、下

26、調的趨勢與模型組相同，且與正常組的差異更甚于模型組。上調的基因大多與免疫、炎癥有關，下調的只有NADH_ ubiqui noneoxidoreductase B9 subunit (Complex I _B9) (Cl B9),為 NADH 呼吸 鏈 組分。LBP屬于I型急性期反應蛋白，對LPS（脂多糖）中的類脂A具有高 度親和性，LBP的N端可以與LPS結合，其C端可以與CD14結合，是LPS發揮生物學作用的重要載體，可增強細胞對低濃度LPS的反應性及炎癥介質的生成32, 33 0這些上調基因似乎與表2所顯示的那樣一一針藥組下調與免疫、炎癥相關基因的表達相矛盾。這充分體現了針藥結合治療抑郁癥

27、其調控機制的復雜性。 由于蛋白質是生物功能的直接體現者，在基因的轉錄過程、基因-蛋白質的翻譯 水平以及蛋白質的修飾過程都可能被外來因素所干預,最后的療效是干預因素共同作用的結果，單純考慮基因的表達并不足以反映全過程。“增偏"基因的出現，表明針藥結合治療抑郁癥并非完美無缺，在獲得確切療效的同時，還會出現某些不利于機體的反應。由于單純 電針 并未出現“增偏”基因，推測是由于氟西汀的副作用引起的。43小結由上述討論可知，電針與針藥治療抑郁癥的機理均涉 及凝血、炎癥和凋亡相關基因的下調表達，以及與蛋白質生物合成有 關的基 因、嗅覺感受器等基因的上調表達。此外，電針還能改善與能量代謝有關 的基

28、因的表達，而針藥結合的優勢體現在強有效地下調凝 血因子V和5 輕色胺2C受體的表達。同時針藥結合的結果還出現'吐曾偏，'基因，可能 是由于氟西汀的副作用引起的，同時可能也是上述聚 類圖中針藥組與正常 組距離更遠的原因。本實驗是電針與針藥治療抑 郁癥大鼠一周時測定的 結果，由于氟西汀起效緩慢，因而該結果亦為 電針和針藥結合治療抑郁癥 快速起效提供了較充分的實驗依據。本實驗不足之處是=限于研究經費，每組大鼠只取一個標本作基因芯片測試，將增加實驗誤差，影響差異表達基因的篩選，要同時進行其他 實驗加以佐證。我們還對其中的6條基因進行realjime PCR驗證，與芯片測試的結果基本相符

29、，表明本次基因芯片測試的數據是可信的。限于篇 幅，本文未將PCR驗證的結果列出。【參考文獻】1段冬梅，圖 婭百優解與電針對輕、中度抑郁癥的有效性評價J中國藥物應用與監測，2008, 5(1) : 1,2張建斌，王玲玲，呂梅，等針刺不同腌穴對抑郁癥模型大鼠行為學的影響J 中國針灸,2005, 25(9) : 639,3張建斌，王玲玲，徐斌，等針藥對抑郁模型大鼠海馬aARmRNA表達的影響J上海針灸雜志，2008, 27(12): 38,4張建斌，王玲玲，呂梅，等針刺對抑郁癥模型大鼠前 額皮質單胺類神經遞質的影響J沖國臨床康復，2006, 10(15) : 129.李忠仁實驗針灸學，第1版M北京:

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