1、引物設計需要注意事項一、PCR引物設計的11條黃金法則1 .引物最好在模板 cDNA的保守區內設計。DNA序列的保守區是通過物種間相似序列的比較確定的。在 NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件(比如DNAman比對( Alignment ) ，各基因相同的序列就是該基因的保守區。2 . 引物長度一般在1530 堿基之間。引物長度(primer length )常用的是18-27 bp， 但不應大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74，不適于Taq DNA 聚合酶進行反應。3 .引物GC含量在40%60%間，Tm值最好接近 72 Co GC含量(composition )過高或過

2、低 都不利于引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值(melting temperature ) 是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高于Tm值510CO若按公式Tm= 4 (G+C +2 (A+T)估計引物的Tm值，則有效引物的 Tm為5580C,其Tm值最好接近72c以使復性條件最佳。4 .引物3'端要避開密碼子的第 3位。如擴增編碼區域，引物 3'端不要終止于密碼子的第3 位，因密碼子的第3 位易發生簡并，會影響擴增的特異性與效率。5. 引物3'端不能選擇 A,最好選擇 To引物3

3、'端錯配時，不同堿基引發效率存在著很大 的差異，當末位的堿基為 A時，即使在錯配的情況下，也能有引發鏈的合成，而當末位鏈為T時，錯配的引發效率大大降低，G C錯配的引發效率介于 A T之間，所以3'端最好選擇 T。6. 堿基要隨機分布。引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3 端相似性較高的序列，否則容易導致錯誤引發(False priming ) 。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚喋吟或聚嘴咤的存在。尤其3'端不應超過3個連續的G或C,因這樣會使引物在 GC富集序列區錯誤引發。7. 引物自身及引物之間不應存在互補序列。引

4、物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成 發夾結構(Hairpin ) 使引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。引物自身不能有連續4 個堿基的互補。兩引物之間也不應具有互補性，尤其應避免3'端的互補重疊以防止引物二聚體(Dimer與Cross dimer)的形成。引物之間不能有連續4個堿基的互補。引物二聚體及發夾結構如果不可避免的話，應盡量使其G值不要過高(應小于4.5kcal/mol ) 。否則易導致產生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行。8 .引物5'端和中間 G值應該相對較高，而 3'端4G值較低。AG值是

5、指DNA雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩定性，4G值越大，則雙鏈越穩定。應當選用51端和中間 G值相對較高，而3'端4G值較低（絕對值不超過 9）的引物。引物3'端的 G值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發DNA聚合反應。（不同位置的 G值可以用Oligo 6軟件進行分析）9 .引物的5'端可以修飾，而3'端不可修飾。引物的5'端決定著PCR產物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5'端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質結合 DN際列；引入點突變

6、、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。引物的延伸是從 3'端開始的，不能進行任何修飾。3'端也不能有形成任何二級結構可能。10 . 擴增產物的單鏈不能形成二級結構。某些引物無效的主要原因是擴增產物單鏈二級結構的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結構區域。用有關軟件（比如 RNAstructure ）可以預測估計 mRNA勺穩定二級結構，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區域自由能（ G° ）小于58.61 kJ/mol 時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區域時，用7-deaza-2 '-脫氧GTP取彳弋dGTP對擴增的成功是有幫助的。11 .引物應具有特異性

7、。引物設計完成以后， 應對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。值得一提的是，各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；用作克隆目的的PCR因為產物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。PCR引物設計的目的是為了找到一對合適的核甘酸片段，使其能有效地擴增模板DNA列。因此，引物的優劣直接關系到PCR勺特異性與成功與否。要設計引物首先要找到 DNA列的保守區。同時應預測將要擴增的片段單鏈是否形成二級結構。如這個區域單鏈能形成二級結構，就要避開它

8、。如這一段不能形成二級結構，那就可以在這一區域設計引物。一般引物長度為1530堿基，擴增片段長度為 100600堿基對。讓我們先看看P1引物。一般引物序列中 G+C含量一般為40%cr"60%而且四種堿基的分布最好隨機。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否則P1 引物設計的就不合理。應重新尋找區域設計引物。同時引物之間也不能有互補性，一般一對引物間不應多于4 個連續堿基的互補。引物確定以后，可以對引物進行必要的修飾，例如可以在引物的5'端加酶切位點序列；標記生物素、熒光素、地高辛等，這對擴增的特異性影響不大。但3'端絕對不能進行任何word.修飾，因為引物的延伸是從 3

9、9;端開始的。這里還需提醒的 是3'端不要終止于密碼子的第3位，因為密碼子第3位易發生簡并，會影響擴增的特異性與效率。綜上所述我們可以歸納十條 PCR引物的設計原則: 引物應用核酸系列保守區內設計并具有特異性。產物不能形成二級結構。 引物長度一般在1530堿基之間。 G+C含量在403 60叱間。 堿基要隨機分布。 引物自身不能有連續 4個堿基的互補。 引物之間不能有連續 4個堿基的互補。引物5'端可以修飾。引物3'端不可修飾。引物3'端要避開密碼子的第 3位。二、引物的二次篩選引物的二次篩選是指在初次篩選出的幾對引物中進一步篩選出適合我們進行特異、高效PCR擴

10、增的那對引物。本步應注意以下兩點，一是得到的一系列引物分別在Genebank中進行回檢。也就是把每條引物在比對工具(/blast/ )的blastnr中進行同源性檢索，棄掉與基因組其它部分同源性比較高的引物，也就是有可能形成錯配的引物。一般連續10 bp以上的同源有可能形成比較穩定的錯配，特別是引物的 3'端應避免連續5-6 bp的同源。二是以mRN徼模板設計引物時要先利用生物信息學的知識大致判斷外顯子與內含子的剪接位點(例如http:/CCR-081./GENESCAN.html 的GENESCAN具或者GeneParser軟件，然后棄掉正好位于剪接位點的引物。三、引物的最終評估當我們經過初次篩選和二次篩選后得到的那對引物便可以用于合成，合成后我們經過PCR擴增可以對引物進行最終的評估。是PCRF增的特異性和效率。經過PC疏件優化后能否獲得特異性條帶，即無目的條帶之外的多余條帶。另外,PCR產