1、復合bFGF緩釋微球的制備與性能測定 作者：劉銳，黃沙，金巖，吳紅，姜玲，劉濤【關鍵詞】 ,堿性成纖維細胞生長因子 Preparation and characteristic test of bFGFimpregnated microsphere【Abstract】 AIM: To prepare the basic fibroblast growth factor (bFGF)impregnated microsphere and to study its characteristics. METHODS: The bFGFimpregnated microsphere was prepa

2、red by improved emulsified coldcondensation method. The physical properties, drug content and encapsulation were detected. The drug release in vitro was measured by ELISA. RESULTS: The average diameter of microsphere was (12.43.6) m, the average drug content was 0.24% and encapsulation was 96.82%. I

3、n vitro, 28.23% of bFGF was sustainedreleased on the first day, 57.19% from the second to the fifth day and 93.94% by the seventh day. CONCLUSION: The preparation method is simple, rapid and accurate and the release of bFGF from the microspheres can be sustained for a longer time.【Keywords】 basic fi

4、broblast growth factor; microsphere; sustainedrelease; encapsulation【摘要】 目的：制備復合堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）的可降解緩釋微球，考察其各項性能，為進一步應用于組織工程奠定基礎. 方法：采用改良的乳化冷凝法交聯制備復合bFGF的緩釋微球，測定微球形態、粒徑、載藥率和包裹率等，并采用ELISA法考察其體外bFGF的緩釋效能. 結果：緩釋微球平均粒徑(12.43.6) m；平均載藥率為0.24%，平均包裹率為96.82%. d 1體外釋放28.23%，25 d時累積釋放率達到57.19%, d 7時釋放減慢且累計濃度

5、為93.94%. 結論：復合bFGF的緩釋微球制備工藝簡便，性能優良；可在較長時間內持續釋放活性bFGF，與組織工程支架的結合應用具有可行性.【關鍵詞】 堿性成纖維細胞生長因子；微球；緩釋；包裹率0引言生長因子的應用一直是組織工程領域的重要課題之一. 它具有多種生物學活性，可提供有利于細胞生長的微環境，促進新生組織血管生成等1. 但由于生長因子半衰期短，溶液進入體內后迅速擴散、變性或酶解，難以保持其生物活性2. 我們制備復合堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)的緩釋微球載體，并考察微球形態、粒徑、載藥率、包裹率及釋放效果等性能，以期利

6、用此種新型載體在較長時期內持續釋放bFGF，為今后與組織工程支架的結合應用奠定基礎.1材料和方法1.1材料明膠(等電點50，相對分子量99 000，華美生物工程公司)，人重組bFGF溶液(25 mg/L，等電點9.6，Sigma公司)，人bFGF定量EIA試劑盒（QuantiKineR, R&Dsystems），250 g/L戊二醛，丙酮，異丙醇，無水乙醚，液體石蠟，氨基乙酸為國產分析純，Span80(Sigma公司)為進E1分析純，水為雙蒸水，JJ1型精確電子攪拌器儀，TGL16G高速離心機，GENESIS凍干機(Virtis公司)，BX41數碼顯微鏡（Olympus).1.2方法1.2.1

7、復合生長因子微球的制備將含有10 g/L Span80的液體石蠟30 mL置于三口瓶中預熱至55，快速攪拌下滴加入同樣溫度的明膠水溶液4 mL，并調節攪拌速度至450 r/min，繼續攪拌10 min；形成油包水乳劑后迅速改冰浴，繼續攪拌10 min，使其完成固化；加入250 g/L戊二醛0.1 mL，攪拌下預固化2 h，4固化24 h，用適量丙酮、異丙醇、乙醚洗滌，揮去乙醚，真空干燥，得淡黃色粉末狀微球，將200 L的bFGF溶液滴加在20 mg的凍干明膠微球上，在室溫下保持30 min以使bFGF完全融入微球. 鈷60照射滅菌封存. 以丙酮為分散劑將空白微球樣本及含有bFGF的微球樣本置于

8、光鏡下，觀察其外形及分散度. 同時測量500個微球的直徑計算其平均粒徑. 以算術平均徑為微球的平均粒徑，計算公式為：平均粒徑=n1d1+n2d2+nndn/n1+n2+n3+nn 式中n1,n2nn為粒子數，d1,d2dn為粒徑.1.2.2微球含量及緩釋性能測定根據人bFGF定量EIA試劑盒說明書配置標準液，在492 nm處測各孔A值. 以標準品0，8，16，31，62，125，250和500 ng/L之A值作出標準曲線并擬合線形回歸方程. 取微球樣品20 mg,放入PBS緩沖液中，加熱至完全溶解，冷卻后再用緩沖液稀釋定容. 測出A492 nm值，然后在標準曲線上查處相應bFGF含量，并由此計

9、算出微球的載藥率以及標準率. 載藥率=（bFGF質量/緩釋微球質量）100%. 包裹率=（bFGF質量/緩釋微球中bFGF理論質量）100%. 取緩釋微球(2 mg)，用PBS緩沖液100 mL作為溶出介質. 藥物體外溶出儀的溫度保持在(37.00.5)磁力攪拌轉速100 rmin. 分別于各時間點(1，2，3，4，5，6，7 d)取樣100 L. 每次取樣后，立即補充同溫度的PBS緩沖液100 L. 按17 d順序，將稀釋10倍的樣品，分別加入微孔板7個孔中，每孔加樣50 L并同時加入樣品稀釋液各50 L. 將反應板充分混勻后置37 120 min. 用洗滌液將反應板充分洗滌46次，向濾紙上

10、印干. 每孔加入第一抗體工作液50 L,將反應板置37 60 min. 洗板，并在每孔中加入酶標抗體工作液100 L.將反應板放置于37 60 min. 洗板后加入底物工作液100 L，置37暗處反應10 min. 每孔中加入一滴終止液，混勻. 在A492 nm處測各孔值. 根據A值在標準曲線上查出相應bFGF含量.百事通 2結果2.1緩釋微球的形態和粒徑空白緩釋微球呈圓球狀，形態及粒徑大小較均勻（Fig 1A）；復合有bFGF的緩釋微球經溶漲體積變大，形態飽滿(Fig 1B). 微球粒徑720 (12.43.6) m，占85.6%.2.2bFGF標準曲線在492 nm處測各孔A值，由此繪制標

11、準曲線（Fig 2）并擬合線性回歸方程為： A=0.0042C+0.0154，r=0.9996 （P0.001），bFGF在0500 ng/L范圍內符合線性關系.2.3緩釋微球中bFGF的含量在492 nm處測定得A值，根據回歸方程計算出相應bFGF含量. 緩釋微球中bFGF質量為4.841 g，由此得出微球平均載藥率為0.24%，平均包裹率為96.82%（n=5）.2.4緩釋微球體外溶出度測定由緩釋微球體外釋放樣品各個時間點的A值得出的bFGF濃度，并由此繪制出微球體外累積釋放量曲線（Fig 3）.A: Blank; B: bFGFimpregnated.3討論bFGF是一類具有較高活性的多

12、聚肽，對多種中胚層和神經外胚層來源的細胞具有廣泛的生物學活性，可改變一些細胞的趨化性，誘導或抑制特殊蛋白質的合成或分泌3. 但由于這種多功能細胞因子半衰期短，易失去活性,應用效果不甚理想. 我們設計的緩釋微球可緩釋藥物、靶向輸送、保證藥物的治療作用的前提下減少給藥劑量以及降低藥物毒性等4. 通過含量測定，緩釋微球對bFGF的包裹率可達96.82%. 體外證實，復合bFGF緩釋微球在7 d內對上皮細胞仍有促進增殖活性5. bFGF的累積釋放量呈緩慢上升趨勢， d 1累積釋放率為28.23%，不存在初始階段的“突釋”現象6；25 d，累積釋放量率57.19%,克服了部分同類產品釋放藥物時初期濃度過

13、大，短期內又迅速降低現象;到7 d時，累積釋放率達到93.94%，雖然釋放速率減慢，但體外仍有bFGF生物活性.本實驗對緩釋載體的研制尚處于實驗室階段，但由于此種緩釋微球性能優良，可以根據組織工程化產品應用的不同需要，生產出包裹其他藥物的緩釋微球，也可同時包裹幾種生長因子發揮聯合調控的作用. 本設計工藝簡便，能較長時間持續釋放活性生長因子，在組織工程研究領域具有廣闊的應用前景.【參考文獻】1 Richardson TP，Peters MCPolymeric system for dual growth factor deliveryJNat Biotechnol, 2001;19(9)：102

14、9-1034.2 Kawai K，Suzuki S，Tabata Y，et al. Accelerated tissue regeneration through incorporation of basic fibroblast growth factorimpregnated gelatin microspheres into artificial dermis J. Biomaterial，2000;21：489-499.3 Kinsella L，Chen HL，Smith JA，et alInteractions of putative heparinbinding domains o

15、f basic fibroblast growth factor and its receptor，FGFR1，with heparin using synthetic peptidesJGlycoconj J，1998；15：419-4224 Maysinger D， Krieglstein K， Filipovic J，et al Microencapsulated ciliary neurotrophic factor：Physical properties and biological activitiesJ Exp Neurol， 1996；138：177-l885 黃沙，金巖, 吳紅. 制備復合生長因子的緩釋微球并考察其對細胞的影響J. 上海生物醫學工程,2004；25（4）：22-25.Huang S, Jin Y, Wu H. Prepar