1、大鼠胚胎背部皮膚發育過程中毛囊干細胞的發育初探                         作者：林森 謝擁軍 李新枝 寧加亮 【摘要】  目的 探討大鼠胚胎背部皮膚毛囊干細胞的發育規律。 方法 使用冰凍超薄切片后固定，結合免疫組織化學染色方法（IHC），顯示出毛囊干細胞的位置和發育程度，然后對醫學陽性程度表達區域使用軟件分析和統計方

2、法處理。 結果 大鼠胚胎背部皮膚呈現逐漸增厚的趨勢，其中毛囊隆突區并不明顯，但可明顯觀察到三種干細胞標記物在皮膚全層，尤其是基底層的表達變化。 結論 形態學觀察說明毛囊發生初期毛囊干細胞(hair follicle stem cell, HFSC)不僅僅定位于毛囊上段，三種HFSC標志物的表達有差異。背部皮膚基底層細胞具有干細胞特性，未分化為表皮細胞或者毛囊中的各種細胞。1?integrin，CD34和K15的表達變化可能與毛囊干細胞以及毛囊的生物學特性有關。 【關鍵詞】  大鼠胚胎； 背部皮膚； 毛囊干細胞    【Abstract】  Ob

3、jective  To detect the development of hair follicle stem cell in developmental rat embryo dorsal skin. Methods  Frozen section and immunohistochemistry were used to investigate the expression of 1?integrin, CD34 and K15. All the expression data was detected by software called Image pro plu

4、s, and then the data was analyzed. Results  Embryo dorsal skin became thicker gradually without bulge region significant, but the expression of stem cell markers, 1?integrin, CD34 and K15 changed obviously in each stage of developmental rat dorsal skin. Conclusion  The results of morpholog

5、y suggest that hair follicle stem cells (HFSCs) do not localize in upper?hair follicle in early stage of hair follicle morphogenesis. The expressions of three stem cell markers were different. Especially, basal layer cells in dorsal skin exhibited stem cell characteristics without differentiating in

6、to epithelial cells or other types of cell in hair follicle. The expression of stem cell markers may be correlated with characteristics of hair follicle and hair follicle stem cells.    【Key words】  rat embryo; dorsal skin; hair follicle; hair follicle stem cell   

7、 皮膚上皮層及其相關結構來源于毛囊內部和毛囊間的兩個干細胞群落，即皮膚基底層干細胞通常形成皮膚各層，而位于毛囊隆突區的干細胞則負責毛發和皮脂腺的再生1。進入生長周期的毛囊可分為四個階段，即生長期(anagen)、退化期(catagen)、靜止期(telogen)和活躍脫毛期(exogen)2, 3。而進入周期之前，毛囊經歷發育階段。促使毛囊發生的第一個信號來源于間充質4, 5，隨后表皮增厚形成基板，真皮細胞在基板下形成結構緊密的微環境，基板向下生長形成毛胚芽，上皮組織包圍真皮緊密微環境從而形成真皮乳頭。    大鼠毛囊的形成經歷胚胎第15.5 d(E15.5)初生

8、階段(E22)，本文據此選擇胚胎發育第15 d(E15)、E16、E17.5和E19四個階段以觀察大鼠胚胎發育過程中背皮中干細胞標志物1?integrin, CD34和K15的表達規律，以此解釋毛囊干細胞(hair follicle stem cell, HFSC)在大鼠胚胎背皮中的發育規律。    1  材料和方法    1.1  材料    近交系Wistar大鼠胚胎(由第三軍醫大學實驗動物中心提供)。CD34兔抗、1?integrin兔抗(武漢博士德)，K15兔抗(Novocas

9、tra)，免疫組化試劑盒(北京中山)。    1.2  實驗方法    第15 d(E15)、E16、E17.5和E19四個階段的背部皮膚。隨機抽取每階段大鼠胚胎6個，剪下每個階段大鼠胚胎的背部皮膚，分置于液氮中待用。樣品放入4%PFA中固定24 h后放入30%蔗糖溶液中脫水40 h左右，于冰凍切片機中OCT包埋劑包埋，切成5 m厚組織片。采用免疫組化染色ABC法檢測大鼠胚胎發育過程中HFSC組織定位以及?NGF和p75NTR的表達。冰凍切片，37下3% H2O2封閉15 min；滴加二抗的正常血清封閉，室溫孵育25 min

10、；吸去封閉血清，勿洗，滴加K15(170)、1?integrin (1100)和CD34(1100)一抗(設PBS空白對照)；4濕盒內過夜；加生物素化二抗和鏈酶卵白素；DAB同時程顯色，鏡下觀察顯色結果；干燥脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。    1.3  圖象分析    使用Nikon 4500全自動數碼CCD采集圖像，用Image pro plus 5.1專業軟件分析染色區域陽性程度累積光密度(IOD)，采用SPSS 11.0中ANOVA方法分析所有樣品IOD染色強度統計值。百事通    2

11、  結果    在胚胎期大鼠背皮研究過程中，可見皮膚的發育呈逐漸增厚的趨勢。在E15時期，大鼠的背皮非常單薄，未觀察到背毛毛囊，各層分層不明顯。隨著胎齡增加至E19時期，可清楚觀察到表皮各層的組織結構。1?integrin主要表達在表皮及其以下的真皮層小細胞群落中。CD34和K15主要表達在表皮層。 E15時期，表皮與真皮不易區分，主要由最外層的34層細胞組成。此時1?integrin不僅在表皮表達，而且還在真皮細胞群落中表達。CD34為陰性。K15在表皮表達很少，圖像軟件并未識別其IOD強度。 E16時期，表皮明顯增厚，1?integrin 和CD34

12、都在表皮中表達，而K15則未見表達。 E17.5時期，CD34和1?integrin主要表達在表皮以及表皮以下的真皮層小細胞群落中，K15無表達。 到E19時期，皮膚結構相對緊湊，層次也較分明，開始出現皺褶，1?integrin 和CD34在棘層中和基底層中表達，而K15僅在基底層中表達。陽性表達IOD差異見表1，表達結果見圖1.表1  胚胎期大鼠背部表皮1?integrin、CD34和K15在胚胎四個時期的平均灰度值(IOD)    3  討論    大鼠皮膚和毛囊的發育從胚胎階段就已經開始。 首先表皮增厚形成基

13、板，緊接著真皮細胞圍繞基板下方形成一個組織結構緊密的微環境。 表皮基板向下生長到真皮形成毛胚芽。 上皮組織包繞組織緊密的真皮環境生長形成真皮乳頭， 圍繞真皮乳頭的細胞則成為毛母質細胞6。真皮乳頭緊靠毛囊上皮組織的永久區域?猜磺?7。    關于表皮干細胞與毛囊干細胞的定位和區分的問題一直存在爭論。20世紀90年代，Cotsarealis等7發現并揭示標記滯留細胞(LRC)位于毛囊隆突部和表皮基底層。Taylor等12利用標記追蹤方法發現毛囊干細胞可雙向分化為表皮干細胞和HFSC，該標記主要定位于表皮基底層和毛囊外根鞘隆突部。HFSC傾向于在表皮受到損傷和毛囊創傷時

14、發揮其增殖分化潛能8。目前一般認為，1?integrin，CD200，CD34，K15是HFSC的主要標記物9?11。 因此可以看出本研究應用的K15，1?integrin和CD34在鼠類的HFSC中有特異性表達，能夠作為HFSC的特異性標志物。  在研究中發現大鼠胚胎背部皮膚基底層的三個干細胞標志物CD34、K15和1?integrin變化呈現不同的趨勢。 這提示皮膚中的干細胞在發育過程中的性質發生變化，并有可能衍生出不同亞群。Morris13認為K15在鼠類毛囊的所有時期都表達，是毛囊干細胞的表面標志物，作者發現胚胎大鼠E19時期，K15在基底層的強烈表達，而其他時期無表達，Wh

15、itbread等同樣發現分裂活躍的皮膚基底層表達K1514， 因此K15在基底層的強烈表達與基底層的干細胞特性關系密切，推測HFSC由其他干細胞衍生而來，在E19時期的大鼠胚胎背皮基底層中分裂活躍。    1?integrin和CD34表達在皮膚全層中，在臨近基底層以及基底層以上表達比較強烈。這與K15的表達部位明顯不同。1?integrin高表達細胞具有更高的克隆形成能力，但1?integrin高表達的細胞中除了表皮干細胞(ESC)外還包含短暫性增殖細胞(TAC)。1?integrin具有粘附功能，因此高水平表達的1?integrin有利于保持干細胞的成簇分布1

16、5。同時，1?integrin和CD34也是表皮干細胞的表面標志物，這提示在E15?E19時期表皮干細胞一直存在，只是數量和位置上有所變化，而K15在E19的突然出現說明HFSC是ESC的子代細胞。 這與Poter等認為K15為成熟基底層KC表型16相符。    只有在體外操作利用間充質信號刺激的情況下，HFSC才會形成新的毛囊11,17。因此，徹底闡明HFSC的發育機制有助于揭示毛囊的形成過程，期望為臨床研究新的毛發生長方法提供一些理論基礎。【參考文獻】  1Alonso L, Fuchs E. Stem Cells of the Skin Epith

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