1、    MTT測定惡性腫瘤細胞對化療藥物的敏感性        摘要：目的探討3-(4.5)-雙甲基-2-噻唑-(2.5)-二苯基溴化四氮唑藍(MTT)法測定惡性腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。方法采用改良的MTT法檢測了189例惡性腫瘤標本對9種化療藥物的體外敏感性。結果51例胃癌細胞對化療藥物的敏感性，由高到低依次為絲裂霉素(MMC)，5-氟脲嘧啶(5-Fu)，順鉑(DDP)，阿霉素(ADM)，阿糖胞苷(Ara-C)，平陽霉素(PYM)，甲氨喋呤(MTX)，足葉乙甙(VP-1

2、6)，長春新堿(VCR)；75例結直腸癌細胞對化療藥物的敏感性，由高到低依次為5-Fu，MMC，PYM，VP-16，MTX，VCR，DDP，Ara-C，ADM。43例肝癌細胞對化療藥物的敏感性，由高到低依次為DDP，MMC，5-Fu，ADM，MTX，Ara-C，VP-16，PYM，VCR；20例乳癌細胞對化療藥物的敏感性，由高到低依次為5-Fu，MMC，DDP，ADM，MTX，PYM，VCR，Ara-C，VP-16。結論MTT法快速、簡便、敏感性高、可評價率高，適用于惡性腫瘤的藥敏試驗，對臨床用藥有指導意義。關鍵詞：抗腫瘤藥，多劑聯用； 藥物敏感試驗； MTT法中分類號：R979.19文獻標識

3、碼：B 抗癌藥物體外敏感性試驗一直是臨床化療界矚目的問題。現今已建立了多種腫瘤化療藥敏試驗方法，但因成功率低和受試條件限制，都未能在臨床推廣應用。由Mosman(1983)1建立的MTT顯色法是近年來用于驗測藥物對腫瘤細胞增殖影響的新指標。MTT法具有簡便、快速、有一定的特異性等優點，作者采用MTT法對189例惡性腫瘤細胞的體外藥物敏感性進行了初步的研究，報告如下。1材料與方法1.1藥品與試劑阿霉素(ADM，意大利愛寶大藥廠)，順鉑(DDP，山東齊魯制藥廠)，5-氟脲嘧啶(5-Fu，上海旭東海普藥業有限公司)，甲胺喋呤(MTX，上海華聯制藥有限公司)，絲裂霉素(MMC，日本協和發酵工業株式會社

4、)，長春新堿(VCR，中國民生藥廠)，平陽霉素(PYM，天津太河制藥有限公司)，阿糖胞苷(Ara-C，北京醫科大學實驗藥廠)，足葉乙甙(Vp16，北京制藥工業研究所實驗藥廠)。MTT(美國Sigma公司)溶于無酚紅的D-hanks液中，過濾除菌，濃度5 mg/ml，避光冷藏；二甲亞砜(DMSO，北京化工廠)；0.2%膠原酶(型，SIGMA公司)；小牛血清(杭州四季青生物材料研究所)；RPMI-1640培養基(美國GIBCO公司)。1.2培養與檢測方法惡性腫瘤細胞取自本院手術標本，共189例，包括胃癌51例，結直腸癌75例，肝癌43例，乳癌20例。標本于無菌條件下快速送實驗室，用D-Hanks液

5、反復沖洗3次，RPMI-1640培養液(內含青、鏈霉素各200 U/ml)適量浸泡10 min，剪除脂肪、纖維及壞死組織，選取標本邊緣生長好，無壞死的癌組織小塊，再次用D-Hanks液清洗，剪碎至約1 mm×1 mm×1 mm大小；對于纖維結締組織較多、質硬的腫瘤加入適量膠原酶消化，37 1 h，并不斷搖動(對于腫瘤組織質地柔軟、含纖維結締組織較少的標本則無需用膠原酶消化)，然后用吸管反復吹吸，吸取細胞懸液過濾，離心洗滌；100目及200目不銹鋼篩將標本研磨過濾，不斷加1640液沖洗，收集濾液離心(1 000轉/min)10 min，再洗2次，使癌細胞純度>90%；并

6、用臺盼藍染色法檢測細胞活性。加入培養液制成細胞濃度為105個/ml的細胞懸液。將細胞懸液接種于96孔板中：實驗組分別加入9種抗癌藥；對照組用培養液替代抗癌藥；空白組僅加入不含細胞的培養液，每組設3-4孔，37 CO2孵箱培養，培養4872 h，向96孔板中各孔加入MTT，繼續培養4 h，去上清液，然后加入DMSO，振蕩10 min，用酶標儀檢測OD值(波長=570 nm)。1.3評價指標和標準評價指標為平均細胞抑制率(IR)，IR=(1-用藥組OD值/對照組OD值)×100%，IR>50%為敏感，30%50%為中度敏感，<30%為耐藥。2結果2.1胃癌藥敏結果51例胃癌細

7、胞對9種藥物的敏感順序為：MMC，5-Fu，DDP，ADM，Ara-C，PYM，MTX，VP-16，VCR(表1)。表151例胃癌體外藥物敏感性試驗結果受檢藥物受檢例數敏感例數中度敏感不敏感敏感率%MMC512125590.25-Fu512024786.3DDP5116251080.4ADM5115221472.5Ara-C518281570.6PYM518251864.7MTX515232354.9VP-1651123923.5VCR515469.8     2.2結直腸癌藥敏結果75例結直腸癌細胞對化療藥物的敏感性，由高到低依次為5-Fu，MMC，P

8、YM，VP-16，MTX，VCR，DDP，Ara-C，ADM(表2)。2.3肝癌藥敏結果43例肝癌細胞對化療藥物的敏感性，由高到低依次為DDP，MMC，5-Fu，ADM，MTX，Ara-C，VP-16，PYM，VCR(表3)。2.4乳腺癌藥敏結果20例乳癌細胞對化療藥物的敏感性，由高到低依次為5-Fu，MMC，DDP，ADM，MTX，PYM，VCR，Ara-C，VP-16(表4)。 表275例結直腸癌體外藥物敏感性試驗結果受檢藥物受檢例數敏感例數中度敏感不敏感敏感率%5-Fu753732692.0MMC753434790.6PYM7524351678.7VP-167513402270.7MTX

9、759353158.7VCR758343356.0DDP758313652.0Ara-C7596612.0ADM754715.3     表343例肝癌體外藥物敏感性試驗結果受檢藥物受檢例數敏感例數中度敏感不敏感敏感率%DDP431622588.4MMC431620783.75-Fu431321979.1ADM4310211272.1MTX439201467.4Ara-C435211760.5VP-164393420.9PYM4363713.9VCR433406.9     表420例乳癌體外藥物敏感性試驗結果受檢

10、藥物受檢例數敏感例數中度敏感不敏感敏感率%5-Fu20117290MMC2088480DDP2078575ADM2059670MTX2039860PYM20281050VCR20171240Ara-C2031715VP-16201195     3討論 化療方案個體化一直是惡性腫瘤治療的一個難題。為此，人們已建立了多種腫瘤化療藥敏測試方法，但都難以作為常規試驗在臨床上推廣應用。Mosman設計的MTT顯色法，因其快速、簡便、結果重復性好及半自動操作，在抗癌藥物篩選領域得到廣泛應用。文獻報導關于MTT測定多是用于血液系統腫瘤及“純”腫瘤細胞的細胞系，而新鮮

11、腫瘤組織，尤其是實體腫瘤組織的藥敏報導則較少24。本研究將手術切除的新鮮腫瘤組織用機械分離及消化分離兩種方法結合應用，經臺盼藍檢測后得到近乎“純”的腫瘤細胞，且實驗結果與文獻報導一致57，說明MTT法可以用于實體瘤的體外藥敏試驗。消化系統腫瘤組織標本常伴有污染，部分腫瘤類型質地堅硬，且常有明顯的纖維結締組織增生，因此其MTT法藥敏試驗的成功率不及血液系統腫瘤。我們在實驗中發現取材是防止污染的關鍵：標本應在切除后即浸泡在抗生素溶液中，并于術后2 h內送實驗室；清除腫瘤表面粘膜組織；取腫瘤邊緣生長好，無壞死的組織，仔細清除脂肪及纖維；選取的標本須反復清洗；在分離腫瘤細胞時用機械分離及消化分離兩種方

12、法結合應用。臨床上，惡性腫瘤普遍存在耐藥性，這使得許多惡性腫瘤的化療效果不滿意。本實驗所用的9種抗癌藥物對腫瘤細胞的抑制率有很大的差異，不同個體的腫瘤細胞，既使組織來源相同，對同一種抗癌藥物的反應各異，而同一病人對不同的抗癌藥反應亦不相同，這可能與惡性腫瘤存在著先天性或獲得性的耐藥性及多重耐藥性有關。通過體外藥敏試驗，在患者化療用藥前，測出其腫瘤細胞對各種藥物的敏感程度，施行化療方案個案化，對提高化療效果，減少盲目用藥，具有一定的指導作用。因此建議在無條件進行藥敏試驗的情況時，可根據本實驗所顯示的結果篩選化療藥物：胃癌首選MMC，次為5-Fu，DDP，ADM；結直腸癌首選5-Fu，次為MMC，

13、PYM，MTX；肝癌首選DDP，次為MMC，5-Fu，ADM；乳癌首選5-Fu，次為MMC。作者簡介：曾慶華(1964-)，女，湖南長沙人，湖南醫科大學附屬湘雅醫院實驗師，主要從事外科實驗室工作。曾慶華(湖南醫科大學附屬湘雅醫院 普外科， 湖南 長沙 410008)呂新生(湖南醫科大學附屬湘雅醫院 普外科， 湖南 長沙 410008)湯輝煥(湖南醫科大學附屬湘雅醫院 普外科， 湖南 長沙 410008)參考文獻：1Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to prolif

14、eration and cytotoxicity assaysJ. Immunol Methods, 1983,65(1-2):55-63.2Alley MC, Scudiero DA, Monks A, et al. Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assayJ. Cancer Res, 1988,48(3):589-601.3Campling BG, Pym J, Galbraith PR, et al. Use of the MTT assay for rapid determination of chemosensitivity of human leukemic blast cellsJ. Leukaemia Res, 1988,12(10):823-831.4Sargent JM, Taylor CG. Appraisal of the MTT assay as a rapid test of chemosensitivity in acute myeloid leukacmiaJ. Br Cancer, 1989,