1、蜂針對(duì)佐劑性大鼠關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響楊順益 林軍 鄧金峰 馮淑蘭 李萬(wàn)瑤 張宏 劉金芝(廣州中醫(yī)藥大學(xué)，39蜂療網(wǎng)，廣州510407)內(nèi)容提要目的:檢測(cè)IL-1B、IL-6在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的表達(dá)，探討蜂針治療RA的作用機(jī)理。方法:將40只大鼠隨機(jī)分為四組，采用PCR微板核酸雜交-ELISA方法檢測(cè)滑膜IL-1B、IL-6的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果:蜂針組和激素組IL-1B、IL-6的mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著性差異，而與模型組比較有顯著性差異。結(jié)論:RA早期IL-1B、IL-6的mRNA表達(dá)水平是上調(diào)的，蜂針治療后可以抑制其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，有利于RA病情的緩解。關(guān)鍵詞 蜂毒療法 類(lèi)風(fēng)

2、濕 IL-1BmRNA IL-6mRNA 基因表達(dá)EffectofAcupoint-apitherapyonCytokineGeneExpressionofSynovialTissuesinAdjuvantArthritisRatsYANGShunyi，LINJun，DENGJinfeng，F(xiàn)ENGShulan，LIWanyao，ZHANGHong，LIUJinzhi(GuangzhouUniversityofTCM，Guangzhou，510407)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性全身性自身免疫性疾病，其病理特征是滑膜慢性炎癥。其關(guān)

3、節(jié)損傷的病理過(guò)程與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失調(diào)密切相關(guān)，其中白細(xì)胞介素1(interleukin-1，IL-1)和白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)異常表達(dá)和失調(diào)可能是其發(fā)病的重要因素。本文采用PCR微板核酸雜交-ELISA方法1，2，觀察蜂針對(duì)RAIL-1B、IL-6mRNA表達(dá)的影響。1材料與方法1.1動(dòng)物處理及分組40只Wistar大鼠，雌雄各半，由中山醫(yī)科大學(xué)提供。體重200+20g觀察2天無(wú)異常，隨機(jī)分為四組，每組10只。參照文獻(xiàn)3，模型組:大鼠右后足趾皮內(nèi)注射Freund氏完全佐劑0105mL致炎;激素組:造模后每只每日經(jīng)腹腔注射012mL醋酸氫化可的松注射液(10mg/2m

4、L);蜂針組:造模后蜂針治療每日1次，每次治療取一個(gè)穴位;正常組:不造模。全部標(biāo)本均為各組治療21天后采取，經(jīng)眼眶靜脈取血后處死，切開(kāi)每只大鼠右膝關(guān)節(jié)囊，切取關(guān)節(jié)滑膜組織10mg，標(biāo)本處理見(jiàn)以下所述。1.2蜂針組選穴及治療方法選取“腎俞”、“足三里”、“命門(mén)”、“大椎”。取穴根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)4并參照人體有關(guān)穴位，以動(dòng)物比較學(xué)方法定位。以75%的酒精消毒所取的穴位，用鑷子輕輕捏住蜜蜂的腰部，將其尾部對(duì)準(zhǔn)穴位，讓其自然螯入穴位后并留針10min，待毒囊中的毒液全部排入后，將毒刺拔除，每只大鼠只螯一個(gè)穴位，以上穴位輪流交替使用。1.3試劑和儀器PCR微板核酸雜交-ELISA試劑盒由第一軍醫(yī)大學(xué)生物學(xué)診斷

5、研究中心提供;PCR儀為上海復(fù)華公司產(chǎn)品;550型酶標(biāo)儀為BIO-RAD公司產(chǎn)品;生物素、底物、Taq酶、dNTP、Ficoll400、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)分別購(gòu)自寶靈曼公司、華美公司和化粵公司。1.4雜交液主要配方20SSC(3mol/LNaCl，0.3mol/L檸檬酸三鈉)、硫酸葡聚糖(PEG)、去離子甲酰胺、十二烷基硫酸鈉(SDS)等;雜交洗液:1SSC;封閉劑:1%Ficoll400，0.5%HS-DNA、0.5%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、1%BSA、脫脂奶粉、甘氨酸。上述溶液均由第一軍醫(yī)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)診斷研究中心提供。1.5引物與探針采用Primer軟件設(shè)計(jì)引物，選用IL-1B、I

6、L-6的特異性序列作為引物與探針，由上海生物工程公司合成。引物與探針序列見(jiàn)表1。表1IL-1B、IL-6引物及寡核苷酸探針序列項(xiàng)目引物序列1.6總RNA提取大鼠眼眶靜脈取血后，即用淋巴細(xì)胞分離液提取外周血單個(gè)核細(xì)胞，按Promega公司提供的試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，得到RNA沉淀，用無(wú)RNase的水溶解，紫外分光光度計(jì)A260/A280nm測(cè)定總RNA濃度和純度，大于1.8表明純度較好。經(jīng)1%瓊脂糖電泳凝膠鑒定，28S及18S條帶清晰，所獲RNA具有較好完整性。于-70度保存。117探針包被與封閉在37度下，用碳酸鹽緩沖液(pH9.6)在微板上包被14hr，用封閉劑封閉微板孔非特異性結(jié)合位點(diǎn)。1.8

7、標(biāo)本處理取滑膜組織標(biāo)本用剪刀剪碎于離心管內(nèi)，加23倍體積的處理液(由第一軍醫(yī)大學(xué)診斷研究中心研制提供)，在65度下不時(shí)振搖3040min，然后在100度的環(huán)境下于12000rpm離心5min，取上清液作為模板液。119基因擴(kuò)增于反應(yīng)管內(nèi)加入模板液4uL及反應(yīng)液9uL，加反轉(zhuǎn)錄液9uLL，55度反應(yīng)50sec，取3uL含有正義引物1、反義引物1、dNTP、Taq酶等的反應(yīng)液及1B100倍比稀釋液各4LL，5種濃度加入大反應(yīng)管內(nèi)，彈勻，上機(jī)，預(yù)變性94e50sec，循環(huán)條件:94度50sec，53度50sec，72度60sec，共循環(huán)38次，最后72度延伸3min，再取其擴(kuò)增產(chǎn)物3uL，加入含有正

8、義引物2、反義引物2等的反應(yīng)液內(nèi)，彈勻，上機(jī)，預(yù)變性94度2min，循環(huán)條件:94度50sec，53度50sec，72度65sec，共循環(huán)38次，最后72度延伸3min。取最后擴(kuò)增產(chǎn)物變性:100度水浴10min，冰浴10min，成為變性產(chǎn)物。110微板夾心雜交與顯色取變性產(chǎn)物20uL、雜交液90uL、顯色探針25uL，輕輕搖勻，50度雜交60min，甩凈。于每孔中加入雜交洗液200uL，置室溫35min，甩凈，再重復(fù)2次。然后在每孔中加入wxk1辣根過(guò)氧化物酶100LL，37e30min后，甩凈，每孔加入洗液200LL，置室溫510min，再重復(fù)2次，每孔加入底物TMB液1滴，終止反應(yīng)，并在

9、酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)測(cè)OD值。1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)，SPSS軟件包處理。2結(jié)果2.1擴(kuò)增片段長(zhǎng)度以提取的RNA作為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的模板，IL-1B、IL-6mRNA最終擴(kuò)增出的片段分別長(zhǎng)為190bp和245bp，與設(shè)計(jì)的IL-1B、IL-6mRNA擴(kuò)增片段長(zhǎng)190bpwxk2和245bp相一致。見(jiàn)圖1。2.2蜂針對(duì)滑膜IL-1B、IL-6mRNA水平的影響蜂針組能顯著地抑制滑膜IL-1B、IL-6的基因表達(dá)，其結(jié)果與激素組無(wú)明顯的差異。見(jiàn)表2。圖1IL-1B、IL-6擴(kuò)增片段長(zhǎng)度表2蜂針對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠IL-1B、IL-6mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響3討論本研究表

10、明，滑膜中IL-1BmRNA、IL-6mRNA的基因表達(dá)在RA病理模型中是上調(diào)的，提示RA早期不僅存在IL-1B、IL-6轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，對(duì)IL-1B、IL-6反應(yīng)的敏感性亦可能增強(qiáng)，且與炎癥程度相關(guān)，IL-1BmRNA、IL-6mRNA的表達(dá)水平具有協(xié)同性，這進(jìn)一步支持了IL-1B、IL-6在炎癥部位具有相互促進(jìn)作用的論斷，這可能是RA發(fā)病的機(jī)制之一。在RA關(guān)節(jié)腔損傷機(jī)理中，IL-1的局部生物效應(yīng)發(fā)揮最為充分4。在RA早期病程中，IL-1可以擴(kuò)大內(nèi)皮細(xì)胞中粘連分子的表達(dá);誘導(dǎo)中性細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的趨化，通過(guò)誘導(dǎo)IL-6的合成參與免疫調(diào)節(jié)過(guò)程5，刺激成纖維樣細(xì)胞的增生;IL-1尚可進(jìn)一步通過(guò)

11、滑膜成纖維細(xì)胞及關(guān)節(jié)軟骨中的軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)PGE2及膠原酶的產(chǎn)生，增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性，促進(jìn)骨的重吸收，造成關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞，且IL-1可對(duì)軟骨和滑膜細(xì)胞造成直接損傷，使RA病變向中、晚期發(fā)展。IL-6是免疫反應(yīng)中的四大炎癥介質(zhì)之一6，RA患者的炎性滑膜可釋放一些細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子可刺激破骨細(xì)胞釋放一些酸性蛋白水解酶，從而導(dǎo)致骨吸收和軟骨鈣化增加7。IL-6異常表達(dá)和失調(diào)是RA的典型特征，關(guān)節(jié)組織中IL-6主要由滑膜細(xì)胞產(chǎn)生，有研究表明，RA早期患者滑膜內(nèi)檢測(cè)到的IL-6的水平顯著增高，其含量是患者血清內(nèi)的280倍，提示IL-6主要在局部病灶內(nèi)產(chǎn)生8。IL-6可刺激B細(xì)胞合成自身抗體，促進(jìn)類(lèi)風(fēng)濕

12、及其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生9，從而加劇炎癥過(guò)程，加重關(guān)節(jié)病變。蜂毒具有多種藥理作用，直接或間接地抗炎止痛、調(diào)節(jié)免疫機(jī)能，并有類(lèi)激素樣的作用。蜂針具有蜂毒和針灸的雙重作用，可以活血化瘀、消腫止痛、通經(jīng)活絡(luò)、祛風(fēng)散寒。本研究說(shuō)明，用蜂針治療RA后可以使IL-1B、IL-6的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)受到抑制，使IL-1B、IL-6的基因表達(dá)下調(diào)，這對(duì)抑制RA滑膜炎癥以及阻斷關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的降解和破壞是十分有利的，能起到保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的作用。其療效與激素治療沒(méi)有顯著性的差異。參考文獻(xiàn)8湯慧華，等.IL-6及TNF-a在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的作用.中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，1998，2(4):2389KotakeSK，KimKJ，etal.Interleukin