1、耐鹽乳酸菌的篩選和鑒定niH!i!摘要：本實驗從醬油廠提供的醬油原醅中分離篩選出耐鹽乳酸菌， 該 菌在 18% 以上 NaCl 濃度的條件下能夠正常生長代謝，初步鑒定其 為四聯球菌屬，可用于高鹽稀醪醬油釀造目前國內尚無耐鹽度達18% 的乳酸菌種 , 該菌種的成功選育為國內首創。關鍵詞 乳酸菌 耐鹽 篩選 鑒定醬油采用高鹽稀醪發酵工藝生產時能有更好的質量和香味。其工 藝上需要在醬醅發酵過程中添加酵母菌和乳酸菌。 然而醬油的含鹽度 高達18% ， 這就需要選育出耐鹽菌種。關于耐鹽酵母的應用報道已 有很多。而乳酸菌方面， 目前在國內菌種庫內尚無耐鹽度達 18% 的菌 種。我們作為醬油大國， 篩選出耐

2、鹽度達 18% 的嗜鹽乳酸菌的意義則 顯得十分重大。本實驗主要對高鹽稀態發酵工藝醬醅中嗜鹽乳酸菌進行分離篩選及鑒定。1材料與方法 1.1材料醬醅、草酸銨結晶紫液（革蘭氏A液）、路哥爾氏碘液（革蘭氏B液）、 蕃紅花紅（沙黃）、生理鹽水。1.2實驗方法 1.2.1分離篩選流程（如圖1）122篩選方法十倍稀釋法、平板涂布法、斜面之字劃線法、平板四分法劃線。1.2.3鑒定方法 1.2.3.1革蘭氏染色法 1.2.3.2過氧化氫酶接觸酶測定取一環瓊脂斜面的培養物，涂于干凈載玻片上，然后加 1滴3%-15% H2O2，若有氣泡產生則為陽性反應，無氣泡為陰性反應。或將3%-15% H2O2加到斜面的菌苔上觀

3、察是否有氣泡的產生。123.3生化鑒定管使用方法挑取待檢菌革蘭氏染色鏡檢，將新鮮菌苔接種于普通肉湯中，37攝氏度培養18-24h。各吸取0.05-0.08ml （約1-2滴）的肉湯培養物 或菌懸液加入每種微量生化管內，將已接種生化管套上無菌塑料帽直 立于三折吸塑短架內，于35-37攝氏度培養箱中培養。1.2.3.4高效液相色譜HPLC測量乳酸含量（圖2）1-11111111 1 t t t t t t (44a Yniiiiites2結果與討論 2.1耐鹽乳酸菌的篩選 2.1.1富集培養分離初篩（如圖3）電耐鹽度能達10%以上的乳酸菌基本都在片球菌屬和四聯球菌屬這 二個屬內。而四聯球菌的耐鹽度

4、更高達18%以上，所以我們分離篩選 的目標在四聯球菌上。四聯球菌的菌落為乳白色，成小圓點狀。顯微 鏡下觀察，菌體四聯或成對，極少成單。這便是我們初篩時的重要依 據。用富集培養基取代分離培養基對醬油曲進行培養在這樣的條件下 培養。兩天后平板上出現的菌落有不少類似于乳酸菌。 將鏡檢為球菌 的菌落挑出，進行液體培養。然后從中篩選出具有四聯形態的菌種。2.1.2菌種的純化（復篩）將初篩菌種在含15%NaCI濃度的液體培養基中培養在培養過程中定期鏡檢，觀察菌種的生長狀況。生長4天后，進行平板涂布、之字形劃線以及平板四分法劃線分離。然后從經培養后的平板和斜面上挑出鏡檢為四聯球菌特征的菌落繼續培養。如此反復

5、，直到確定其為單一菌株為止。最后在OLYMPUS BX51型正置照相顯微鏡下的觀察。對菌種進行保藏。2.2耐鹽乳酸菌的鑒定 221菌落形態待鑒定菌的菌落形態，成乳白色，油脂狀。在 30攝氏度pH約7.0的液體培養基和瓊脂平板或斜面上均能正常生長。2.2.2革蘭氏染色和過氧化氫酶測定對所篩菌種做革蘭氏染色，成陽性反應。利用電子顯微鏡對菌種拍照如圖9。4008 eSK2.2.3 pH值對待鑒定菌種生長的影響在片球菌與氣球菌的鑒別上，pH值是一個重要的區分因素。片球 菌在pH5下能生長，而氣球菌則不能；在PH9.0的情況則正好相反。本實驗分別做了液體培養基初始pH=4.5和9.0下的生長情況記錄。表

6、1初始PHM4+5時的生長記錄培養時間初始培養時，OD(500記錄1天0.356工忑0.4013天0.418表2初始pH=9. 0時的生長記錄培養時間初始培養基pH = 9 0時,OD財記錄1兔0*3611夭1J086氏kPSO乳酸菌在其生長過程中會產生乳酸、醋酸等有機酸，從而降低培養基的pH值。而當pH值降低到一定程度后，又會反過來抑制乳 酸菌的生長。從表2可看到在培養基初始pH=4.5的情況下，該菌種 還能生長，但從第二天開始，生長則變得比較緩慢。所以，可得出結 論：待鑒定菌是可以在pH =5.0下生長的。由于沒能找到能有效維持液體培養基pH值在9.0的緩沖溶液,所以，即使初始pH為9.0

7、，但伴隨著極少數乳酸菌的生長代謝，溶 液pH值也將不斷下降，從而使其逐漸變得適合該菌生長。所以初始pH =9.0的這組生長記錄數據不能取用。但我們可以從表中看到從第四天到第六天，OD600值有很大的提高。驗證了前面培養基會逐漸 變得適合菌種生長的推斷。基于以上數據 我們判斷待鑒定菌為片球菌屬。3 結論3.1 酪蛋白水解物具有明顯促進酸奶發酵的作用。 隨水解物添加量增 加，促進發酵程度提高 1.5%-2.0% 添加量的水解物對酸奶的促發酵效 果接近。3.2 添加酪蛋白水解物改變了酸奶發酵過程中的 pH 下降：速度添加 樣在發酵前4h的pH下降速度高于空白樣，而發酵4h后空白樣的pH 降速度略快；發酵中期，二者的 pH 下降速度存在最大差距。3.3 不同水解程度的酪蛋白水解物 ，在對酸奶的促發酵程度上，表 現出隨水解程度增加，促發酵程度提高除 2h水解物的促發