1、骨髓間充質干細胞對體外損傷心肌細胞凋亡的影響         11-03-24 10:43:00     編輯：studa20                作者：郭俊芳, 張贏予， 莫亞宏， 王好， 周艷芳， 張國輝 【摘要】  目的： 探討骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells， MSCs)

2、在體外共培養條件下對多柔比星(doxorubicin， DOX)損傷心肌細胞凋亡的影響及可能機制。方法： 貼壁法分離、培養骨髓間充質干細胞，第3代MSCs用于實驗。原代培養3天的SD乳鼠心肌細胞，1.0 mg/L濃度的DOX處理4 h，建立心肌細胞損傷模型。將心肌細胞分為正常對照組、DOX損傷組、DOX損傷+MSCs共培養組。ELISA法檢測細胞條件培養基內胰島素樣生長因子1(insulinlike growth factor 1，IGF1)的濃度。MTT檢測MSCs條件培養基對DOX損傷心肌細胞活性的影響。并檢測各組心肌細胞caspase9,caspase3活性及各組心肌細胞凋亡率。結果：

3、第3代MSCs及原代心肌細胞均有IGF1分泌，但MSCs條件培養基內IGF1的濃度明顯高于心肌細胞。MSCs共培養組心肌細胞活性高于DOX損傷組，但低于正常對照組（P<0.05)。DOX損傷+MSCs共培養組caspase9,caspase3活性及心肌細胞凋亡率低于DOX損傷組，但高于正常對照組（P<0.05)。結論： MSCs對多柔比星誘導的心肌細胞凋亡有保護作用，這種保護作用與旁分泌機制有關。 【關鍵詞】  骨髓間充質干細胞； 心肌細胞； 共培養； 凋亡    Abstract  Objective:  To inve

4、stigate the effects of mesenchymal stem cells(MSCs) on doxorubicin（DOX）injured cardiomyocytes apoptosis in vitro on the condition of coculture and the possible mechanism.Methods： Mesenchymal stem cells(MSCs) were isolated and purified by adherentscreening method, then expanded in vitro.The third pas

5、sage was used for study.The primary cultured neonatal SD rat cardiomyocytes were exposed to 1.0 mg/L Doxorubicin for 4 h to establish experimental model of toxic cardiomyocytes after having been cultured for 3 days.The cardiomyocytes were divided into 3 groups: cultured alone(control group), DOXinju

6、red, DOXinjured and cocultured with the MSCs.The level of insulinlike growth factor 1(IGF1) in the conditioned medium was measured with ELISA kit.The effects of MSCscondition medium on cardiomyocytes viability was determined by MTT assay.The activity of caspase9 and caspase3 were measured by caspase

7、 kits.The cardiomyocyte apoptosis was detected by Annexin VFITC. Results：  IGF1 was significantly higher in the medium from cultured MSCs than in the medium from cultured cardiomyocytes.The viable cell number was larger in MSCsconditioned medium group than that of DOXinjured group, but both dec

8、reased compared to control group(P<0.05).The activity of caspase9,caspase3 and the apoptosis rate decreased significantly in cocultured group compared with the DOXinjured group, but increased compared to control group（P<0.05). Conclusion： It  was concluded that paracrine mediators secrete

9、d by MSCs were involved in preventing DOXinduced cardiomyocytes apoptosis.    Key words  mesenchymal stem cells； cardiomyocytes； coculture； apoptosis    近年來，骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)由于具有獲取方便、分化能力強、低免疫原性且無排斥反應等優點, 在修復損傷心肌、改善心功能方面有很大臨床應用潛力，被國內外眾多研究者所關注。傳統

10、觀點認為，骨髓間充質干細胞在受損心肌微環境內能定向分化為心肌細胞1，改善心臟功能。但近來的一些研究對這種觀點提出了質疑，認為細胞治療促進了內生性的修復過程，而不是心肌細胞和血管內皮細胞的再生，旁分泌作用可能是其修復作用的基礎2。本實驗通過骨髓間充質干細胞與多柔比星(doxorubicin，DOX)損傷心肌細胞的體外非直接接觸共培養，觀察MSCs對體外損傷心肌細胞凋亡的影響，并探討其可能作用機制。    1  材料和方法    1.1  主要材料和試劑clone公司），胎牛血清（GIBCO公司），LDMEM干粉培養基

11、（GIBCO公司），胰蛋白酶（Sigma公司），型膠原酶（Sigma公司），甲基四唑藍（MTT，Sigma公司），橫紋肌肌動蛋白抗體免疫組化試劑盒（SA，武漢博士德生物技術有限公司），Caspase3和Caspase9檢測試劑盒（南京凱基生物科技公司），Annexin VFITC細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技公司），多柔比星(DOX，浙江海正藥業有限公司)。    1.2  細胞分離和培養    1.3  DOX誘導心肌細胞損傷模型及共培養體系的建立    新分離并差速培養后的原

12、代心肌細胞，按3×105/ml的濃度加入96孔培養板（200  l/孔）或6孔培養板（3 ml/孔），置CO2培養箱中培養，培養72 h后用于實驗。加入終濃度為1 mg/L的DOX（以含10%新生牛血清的LDMEM培養基配制）作用4 h，更換無血清培養基或含10%新生牛血清的LDMEM培養基。成功建立心肌細胞損傷模型后，在6孔培養板內置入插入式培養皿Millicell裝置，Millicell裝置內加入第3代MSCs懸液，心肌細胞和MSCs的比例為11，建立共培養體系。    1.4  細胞條件培養基的制備及IGF1的測定 &

13、#160;  取傳至第3代的MSCs及原代心肌細胞，分別按3×105/ml的濃度加入6孔培養板，常規培養24 h后更換為無血清培養基，繼續培養48 h后吸取培養板內的培養基，2 000 r/min離心10 min，留取上清液作為條件培養基，20保存。ELISA試劑盒檢測條件培養基內胰島素樣生長因子1（IGF1）的濃度。    1.5  實驗分組    按照實驗要求分為正常心肌細胞對照組，DOX損傷組，DOX損傷+MSCs共培養組或DOX損傷+MSCs條件培養基組。    1.

14、6  檢測指標及方法    1.7  統計學處理    實驗數據以均數±標準差(±s)表示，用SPSS11.5統計軟件進行處理，多組均數間比較采用方差分析，P< 0.05為差異有統計學意義。    2  結  果    2.1  MSCs培養、擴增和鑒定    原代MSCs培養24 h后即有少量細胞貼壁，細胞形態呈多邊形或梭形，隨著時間的推移，貼壁細胞增多，并可見細胞克隆

15、形成，第710天左右細胞可達80%90%融合。傳代的細胞生長比原代要快，12 h后幾乎全部貼壁并迅速分裂增殖，形態更均勻，為成纖維樣，排列呈螺旋狀或漩渦狀。流式細胞儀檢測第3代MSCs CD90(動物干細胞表面標志)表達陽性，陽性率達94.2%，而CD45(造血細胞表面標志)陰性。    2.2  心肌細胞培養和鑒定    差速培養后的心肌細胞呈圓形，0.3%臺盼藍染色顯示心肌細胞存活率在90%以上。培養12 h后細胞基本貼壁，逐漸變為梭形、三角形、多邊形等形態，并出現自發性搏動，第3天細胞伸出的偽足相互接觸交織成網，逐漸形

16、成細胞簇，搏動呈同步性，頻率為80150次/min。SA免疫組化染色顯示胞質肌動蛋白染色陽性細胞在95%以上。    2.3  條件培養基內IGF1測定結果    結果顯示體外培養的MSCs及心肌細胞均有IGF1的分泌，但MSCs條件培養基內IGF1的濃度明顯高于心肌細胞條件培養基（圖1），差異有統計學意義（P<0.05)。    2.4  MSCs條件培養基對DOX損傷心肌細胞活性的影響    實驗結果表明，DOX損傷組心肌細胞活性明顯下降，DOX損傷+MSCs共培養組心肌細胞活性增加，但仍低于正常心肌細胞對照組，差異有統計學意義（圖2）。    2.5  各組心肌細胞caspase9和caspase3活性的變化    檢測結果如表1所示，DOX損傷組及MSCs共培養組心肌細胞caspase3,caspase9 活性均明顯高于正常對照組，而MSCs共培養組caspase3,caspase9 活性低于DOX損傷組，差異具有統計