1、實驗一 質粒的提取酶切實驗目的掌握質粒小量快速提取法。用瓊脂糖凝膠電泳法鑒定其純度。實驗原理質粒是一種染色體外的穩定遺傳因子。 大小在1200kb之間，具有雙鏈閉 合環狀結構的DNA分子。主要發現于細菌、放線菌和真菌細胞中。質粒具有自主 復制和轉錄能力， 能使子代細胞保持它們恒定的拷貝數， 可表達它攜帶的遺傳信 息。他可獨立游離在細胞質內， 也可整合到細菌染色體中， 它離開宿主的細胞就 不能存活，而它控制的許多生物學功能卻賦予宿主細胞的某些表型。采用溶菌酶可破壞菌體細胞壁，十二烷基磺酸鈉(SDS可使細胞壁裂解， 經溶菌酶和陰離子去污劑(SDS處理后，細菌DNA纏繞附著在細胞壁碎片上， 離心時易

2、被沉淀出來，而質粒DNA則留在上清液中。用酒精沉淀洗滌，可得到質 粒 DNA。在細胞內，共價閉環DNA(cccDNA常以超螺旋形式存在。若兩條鏈中有一 條鏈發生一處或多處斷裂， 分子就能旋轉而消除鏈的張力， 這種松弛型的分子叫 作開環DNA(ocDNA。在電泳時，同一質粒如以 cccDNA形式存在，它比其開環 和線狀DNA的泳動速度都快，因此在本實驗中，質粒 DNA在電泳凝膠中呈現3 條區帶。限制性內切酶是一種工具酶，這類酶的特點是具有能夠識別雙鏈 DNA分子上 的特異核苷酸順序的能力，能在這個特異性核苷酸序列內，切斷DNA的雙鏈，形 成一定長度和順序DNA片段。EcoR I和Bgl II的識

3、別序列和切口是：EcoR I : GJ AATTCBgl II : A J GATCTG, A等核苷酸表示酶的識別序列，箭頭表示酶切口。限制性內切酶對環狀 質粒DNAt多少切口，就能產生多少酶切片段，因此鑒定酶切后的片段在電泳凝 膠的區帶數， 就可以推斷酶切口的數目， 從片段的遷移率可以大致判斷酶切片段 大小的差別。用已知分子量的線狀DNA為對照，通過電泳遷移率的比較，就可以 粗略推測分子形狀相同的未知 DNA的分子量。實驗步驟（一）質粒的提?。ǘ?.培養細菌 將帶有質粒DHa勺大腸桿菌接種于5ml含100卩g/ml氨芐青 霉素的1X LB中，37C培養過夜。2. 取液體培養菌液置塑料離心管

4、中，10 000r/min離心lmin，去掉上清液。加入 150卩l溶液I，充分混勻，在室溫下放置10min。3. 加入200卩l新配制的溶液II，加蓋后溫和顛倒510次，使之混勻，冰上放 置 2min。4. 加入150卩l冰冷的溶液III，加蓋后溫和顛倒510次，使之混勻，冰上放置 10mi n。5. 用臺式高速離心機，10 000r/min離心5min,將上清液移入干凈的離心管中。6. 向上清液中加入等體積酚/氯仿（1: 1, v/v ），振蕩混勻，轉速10 000r/min ， 離心2min,將上清液轉移至新的離心管中。7. 向上清液加5mol/LNaCI至終濃度為L,混勻，再加入2倍體積無水乙醇，混 勻，室溫放置2min，離心5min，倒去上清乙醇溶液，把離心管倒扣在吸水紙上， 吸干液體。8. 加70%乙醇，振蕩并離心，倒去上清液，真空抽干或室溫自然干燥。9. 加入50卩l含RNase A 20卩g/ml的TE緩沖液溶解提取物，室溫放置 30min 以上，使DNA充分溶解待用或置-20 C備用（也可用試劑盒按操作步驟提取質粒）10. 將抽提出來的質粒進行瓊脂糖凝膠電泳（三）質粒的酶切和鑒定質粒DNA酶切的加樣重組質粒5 yL10X