1、腎上腺髓質素抑制溶血磷脂酸的促平滑肌細胞增殖作用摘要目的和方法：在培養的家兔血管平滑肌細胞上，觀察了腎上腺髓質素(Adm)對溶血磷脂酸(LPA)誘導的DNA合成和絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)活性途徑激活的影響。結果：LPA使3H-TdR摻入和MAPK活性增加，Adm對基礎水平的MAPK活性和3H-TdR的摻入并無顯著影響，但Adm對LPA刺激3H-TdR摻入和MAPK活性具有抑制作用。結論：Adm和LPA相互作用參與血管平滑肌細胞增殖的調節。主題詞肌，平滑，血管；細胞；家兔 Adrenomedullin inhibits the lysophosphatidic acid-induced p

2、roliferation of vascular smooth muscle cellsWANG Xiao-Hong,SU Jia-Lin,LI Xia,AN Guo-Shun,AN Song-Zhu, TANG Jian,TANG Chao-Shu,WANG Shu-Heng,LIU Nai-KuiInstitute of Cardiovascular Basic Research,Beijing Medical University,Beijing(100083)AbstractAIM and METHODS:The effect of adenomedullin(Adm) on lyso

3、phosphatidic acid(LPA)induced DNA synthesis and mitogen-activated protein kinase(MAPK) activity in cultured vascular smooth muscle cells(VSMCs) of rabbit was observed.RESULTS：LPA enhanced the cultured VSMCs 3H-TdR incorporation and increased MAPK activity concurrently. Adm could not affect basal MAP

4、K activity or 3H-TdR incorportion,but inhibit LPA-induced 3H-TdR incorporation and MAPK activity in a concentration-dependent manner.CONCLUSION：The action between Adm and LPA may play an important role in regulating the proliferation of VSMCs.MeSHMuscle,smooth,vascular;Cell;Rabbits血管平滑肌細胞(vascular s

5、mooth muscle cells,VSMCs)增殖在高血壓、動脈粥樣硬化和血管形成術后再狹窄等心血管疾病中具有重要發病學意義，確切增殖機理目前尚未完全闡明，已知受到體內多種神經-內分泌因子的網絡調節所控制1。溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)是近年新發現的磷脂類信號分子，心血管組織富含其受體，本室實驗表明LPA是VSMC的強效絲裂素原，促增殖作用與激活細胞內絲裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)途徑有關。腎上腺髓質素(adrenomedullin,Adm)是強效舒血管肽，具有抑制血清、生長因子和內皮素等

6、激活MAPK和促進平滑肌細胞增殖的作用2。本工作在培養的家兔血管平滑肌細胞上，觀察Adm對LPA誘導的DNA合成和MAPK途徑激活的影響，以認識Adm與LPA對VSMC增殖調節的相互作用。材料與方法大耳白兔由軍事科學院動物中心提供；18：1-LPA為Sigma產品；Adm由Phoenix Pharmaceutical,Znc(USA)惠贈；32P-ATP購自Dupont NEN(111 TBqmmol)；MAPK單克隆抗體為Zymed Lab Inc產品；EMEM培養基，髓磷脂化堿性蛋白(myelin basic protein,MBP)為Sigma產品。余為市售分析純產品。1.VSMC培養：

7、取3月齡大耳白兔胸主動脈，以貼塊法3在37通有95%空氣的含有20%小牛血清的EMEM培養液中，在培養箱內傳代培養，實驗用第四代細胞，按5105cell孔接種于24孔培養板培養48 h,用無血清EMEM液再孵育24 h，按下列不同藥物進行實驗。實驗分組：(1)對照組：不加特殊試劑；(2)LPA組：加LPA 10-8molL；(3)Adm組：加Adm 10-7molL；(4)LPA+Adm組：在加入10-8molL LPA基礎上，分別加入10-9、10-8、10-7molL Adm.2.DNA合成測定4：按上述分組加入不同藥物孵育4 h后，加入3H-胸腺嘧啶核苷(3H-thymidine,3H-

8、TdR)1.85104Bq孔，再孵育10 h。冷PBS液終止反應，在Millipore 儀器上經微孔濾膜(0.45m)收集并洗凈細胞，濾膜干燥后加入閃爍液，在閃爍計數儀上測定3H放射活性。3.MAPK活性測定：參照本室以前報告的方法5，按前述分組加入不同藥物后孵育10 min，用冷PBS液洗滌細胞，加入細胞溶解液并超聲破碎細胞，細胞溶解液與按MAPK的單克隆抗體孵育提取免疫復合物以MBP為底物，加入-32P-ATP始動反應，用濾紙(P81phosphocelluse)測定MAPK活性。6次實驗每次進行雙平行孔操作，結果以s表示，方差分析組間q檢驗作統計學處理。結果一、腎上腺髓質素抑制溶血磷脂酸

9、誘導的3H-TdR摻入：在對照組，培養VSMC 3H放射性活度為7563105 counts.min-1孔，10-8molL LPA可使VSMC 3H-TdR摻入增加34%(P0.01)，LPA分別與10-9，10-8，10-7molL Adm合用時，VSMC3H-TdR摻入較LPA單用時分別低9%(P0.05)，12%和17%(P分別0.05和0.01)。單用Adm 10-7molL對3H-TdR摻入無明顯影響(7020940 counts.min-1孔，與對照組比較，P0.05)。結果如1所示。Fig 1Effect of Adm on LPA-induced 3 H-TdR incorp

10、oration in cultured rabbit VSMC(s，n=6) *P0.01 vs control; #P0.05,P0.01，vs LPA；AAdrenomedulin1腎上腺髓質素對溶血磷脂酸誘導的兔血管平滑肌細胞3H-TdR摻入的影響二、腎上腺髓質素抑制溶血磷脂酸誘導的絲裂素活化蛋白激酶激活：在對照組，MAPK活性為(2157105) counts.min-1孔，10-8molL LPA可使MAPK活性增加49%(P0.01)，LPA(108mol/L)與109、108、107molL Adm合用時，MAPK活性分別降低11%(P0.05)、32%和67%(P分別0.05和

11、0.01)。單用Adm10-7molL對MAPK活性無明顯影響(199713 counts.min-1孔，與對照組比較P0.05)。結果如2所示。Fig 2Effect of Adm on LPA-induced MAPK activation in cultured rabbit VSMC(s,n=6) *P0.01 vs control；P0.05，#P0.01，vs LPA2腎上腺髓質素對溶血磷脂酸誘導的兔血管平滑肌細胞MAPK活性的影響討論LPA由膜磷脂經過磷脂酶D和磷脂酶A降解生成，是血清中的正常成分，主要以結合蛋白的形式存在。血液中LPA主要來源于活化的血小板，也可由成纖維細胞和V

12、SMC受刺激后產生。LPA具有促平滑肌收縮和增殖作用，其絲裂原效應通過MAPK途徑介導6。MAPK途徑是細胞外信號引起細胞增殖、分化等核反應的共同途徑或會聚點。興奮G蛋白偶聯受體的物質和激活酪氨酸激酶的物質刺激細胞分裂時，都要通過激活MAPK，使轉錄因子磷酸化而改變基因的表達水平。最近發現Adm可以抑制他們的絲裂素作用2。本工作發現，LPA促進平滑肌細胞增殖，表現為3H-TdR摻入、MAPK活性增加，與文獻報道一致7。VSMC富含Adm受體，血管內皮細胞是血漿和血管組織Adm的主要來源，通過循環分泌和旁分泌方式不僅調節血管張力，而且調節平滑肌細胞的增殖。本工作發現，Adm對VSMC基礎水平的M

13、APK活性和3H-TdR摻入并無明顯影響，但Adm對LPA刺激的3H-TdR摻入和MAPK活性具有抑制作用。有報道，Adm通過第二信使cAMP發揮作用。推測cAMP促進蛋白激酶A激活從而抑制Ras到Raf-1的信號轉導，進而阻斷MAPK的激活抑制平滑肌細胞增殖8。Adm與LPA相互作用對VSMC增殖調節的生理、病理生理意義值得進一步研究。作者單位：北京醫科大學心血管基礎研究所(北京100083)參考文獻1Schwartz SM,Majesky MW,Murry CE.The intima:development and monoclonal responses to injury.Athero

14、sclerosis,1995,118(Supple):S125.2李田昌，田青，趙東，等.腎上腺髓質素抑制內皮素的促平滑肌細胞增殖作用.高血壓雜志，1996，4：171.3Hirata Y,Taragi,Takata S. CGRP receptor in cultured vascular smooth muscle and endothelial cells.Biochem Biophys Res Commun,1988,15:1113.4李田昌，龐永政，唐朝樞，等.絲裂素活化蛋白激酶活性測定.基礎醫學與臨床，1996，16：155.5李田昌，佟利家，龐永政，等.絲裂素活化蛋白激酶參與內皮素刺激的兔主動脈平滑肌細胞增生.生理學報，1996，48：337.6Tokumura JA,Limori M,Nishioka Y,et al.Lysophophati