1、螺旋藻多糖對(duì)小鼠脾細(xì)胞中環(huán)腺苷酸濃度的影響摘要目的:對(duì)螺旋藻免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)理進(jìn)行研究。方法:采用競(jìng)爭性蛋 白結(jié)合分析法，研究螺旋藻多糖(Spirulina platensis polysaccharides,SPP)對(duì)小鼠 脾細(xì)胞中第二信使環(huán)腺苷酸(cAMP)濃度的影響。結(jié)果:SPP可劑量依賴性引起 小鼠脾細(xì)胞中cAMP濃度的升高。結(jié)論:SPP免疫調(diào)節(jié)作用的重要機(jī)制之一是對(duì) 脾細(xì)胞中第二信使cAMP濃度的影響。關(guān)鍵詞螺旋藻多糖，環(huán)磷酸腺苷，脾細(xì)胞Effect Spirulina platensis polysaccharides on cellular cAM P level in muri

2、ne splenocyteYu Fa,Zhang Bin,Ye Zhengjun,et al (Department of Phar macy,Guangzhou Hospital of Air Force,PLA,Guangzhou 510602)ABSTRACTOBJECTIVE:To study the immunoregulatory action of Spirulina platensis polysaccharides(SPP).METHODS:The impact of SPP on splenocyte cAMP level as the second messenger i

3、n mice was in investiga ted.RESULTS:SPP could increase the cellular cAMP level in spleno cyte dose-dependently.CONCLUSIONS:The results showed that one o f the most important immunoregulatory actions be to affect the cAMP level as the second messenger in spleuocytes.KEY WORDSSpirulina platensis polys

4、accharides,cAMP,splenocyte螺旋藻(Spirulina platensis)為富含營養(yǎng)成分的鹵藻類，因其具有抗輻射、抗腫瘤及 免疫增強(qiáng)功能而引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。近幾年的研究表明，螺旋藻抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié) 作用的生理活性物質(zhì)是螺旋藻多糖(SPP)1。但其藥理作用機(jī)制并不明確。本文采 用競(jìng)爭性蛋白結(jié)合分析法，通過研究SPP對(duì)小鼠脾細(xì)胞中第二信使cAMP濃度的影響，期望為 闡明SPP的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制提供有效線索，現(xiàn)報(bào)告如下。1材料1.1藥品與試劑SPP：按文獻(xiàn)提取1。螺旋藻干粉(由深圳藍(lán)藻 公司提供)用80 去離子水提取，95%乙醇沉淀，去游離蛋白，再沉淀得白色粉末粗多

5、糖。 其主要成分為蛋白質(zhì)、糖和脂肪，其含量之比為62%22%6%。cAMP測(cè)定藥盒(中國原子能 科學(xué)研究院產(chǎn)品，批號(hào)971025)。RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO生命技術(shù)公司產(chǎn)品，批號(hào)970806) ，使用時(shí)配成RPMI-1640完全培養(yǎng)基，內(nèi)含25 mmolL-1 Hepes、25 mmolL-1 L-谷胺酰胺、100 IUml-1青霉素、100 gml-1鏈霉素、0.2%碳 酸氫鈉、10%胎中血清。2，5-二苯基卟惡唑(PPO)，1，4-雙-二-(5-苯基卟惡唑基)苯(POPOP)(上海化學(xué)試劑二廠產(chǎn)品)。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/C純系小鼠，雌雄不限，68周齡，體重(18.8 1.6

6、)g，由中山醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.3儀器放射免疫測(cè)定儀，LS900型，Beckman公司；CO2培養(yǎng)基，日立 公司；醫(yī)用離心機(jī)，上海醫(yī)用儀器廠；超聲波處理機(jī)，JC-4型，通化市超聲設(shè)備廠。2方法2.1細(xì)胞培養(yǎng)按文獻(xiàn)方法2無菌取小鼠脾細(xì)胞，經(jīng)苔盼藍(lán)染色 細(xì)胞活率95%以上，調(diào)整細(xì)胞濃度為107106 ml-1，接種于多孔培養(yǎng)板中，加入 RPMI-1640完全培養(yǎng)基，置含5% CO2，95%空氣孵箱中，37 孵育。實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組以RP MI-1640完全培養(yǎng)基替代，實(shí)驗(yàn)組中處理因素以RPMI-1640完全培養(yǎng)基溶解和稀釋。2.2小鼠脾細(xì)胞中cAMP的測(cè)定32.2.1樣品提取取和SPP培養(yǎng)一

7、定時(shí)間的脾細(xì)胞，冰浴下超聲粉碎，3 000 rmin-1離心10 min，去除沉淀。上清液在70 75 水浴下蒸干。2.2.2cAMP的測(cè)定按cAMP測(cè)定藥盒說明進(jìn)行。采用競(jìng)爭性蛋白結(jié)合分析 法測(cè)定cAMP含量，整個(gè)反應(yīng)都在冰浴下進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后，于測(cè)量杯中加入閃爍液PPO和POP OP，蓋嚴(yán)，搖勻，在液體閃爍儀上測(cè)定放射性活度，測(cè)得的結(jié)果按要求作標(biāo)準(zhǔn)曲線并求算樣 品cAMP含量。3結(jié)果3.1SPP對(duì)小鼠脾細(xì)胞中cAMP濃度的影響以400 gml-1 SPP按一定時(shí)間作用于小鼠脾細(xì)胞后，測(cè)定其中cAMP含量，結(jié)果見表1。可見，SPP可引起小 鼠脾細(xì)胞cAMP含量快速升高，10 min達(dá)峰值，之

8、后慢慢下降，至30 min恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。實(shí) 驗(yàn)中測(cè)得的cAMP的基礎(chǔ)水平為(1.770.26)nmolL-1。表 1SPP與小鼠脾細(xì)胞中cAMP濃度的時(shí)效關(guān)系(n=6，s) 時(shí)間mincAMP/nmolL-1時(shí)間mi ncAMP/nmolL-1SPP對(duì)照組SPP對(duì) 照組25.30.81.780.31156.40.81.800.1958.41.01.720.21301.80.41.720.181010.10.71.740.23601.80.31.760.24 3.2SPP與小鼠脾細(xì)胞中cAMP濃度的量效關(guān)系分別以100，200，40 0，800 gml-1 SPP作用于小鼠脾細(xì)胞10 min后

9、，測(cè)定其中cAMP含量，結(jié)果見表2 。從表2中可以看出，在100800 gml-1劑量范圍內(nèi)，SPP與cAMP之間的量效關(guān)系 具有劑量依賴性(r=0.917 6)。 表 2SPP與小鼠脾細(xì)胞中cAMP濃度的量效關(guān)系(n=6，s) 劑量gml-1 cAMP/nmolL-1劑量gml-1cAMP/nmolL-1SP P對(duì)照組SPP對(duì)照組1005.20.81.740.2140010.40.91.740.292008.70.71.710.1980012.51.01.760.314討論多糖是由單糖連接在一起的多聚物，是構(gòu)成生命的三大基礎(chǔ)物質(zhì)之一。多糖尤其是中藥多糖 以其獨(dú)特的作用成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一，但大部分多糖的作用機(jī)制尚未闡明。在細(xì)胞信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中，cAMP是調(diào)節(jié)機(jī)體生理功能和生化代謝的重要生物活性物質(zhì)。作為重要的第二信 使，cAMP參與基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，其信使作用通過依賴cAMP蛋白激酶(PKA)所調(diào)控，同維持和 調(diào)節(jié)生物功能密切相關(guān)。我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SPP可劑量依賴性引起小鼠脾細(xì)胞中cAMP濃度的升高，提示這可能是SPP免 疫調(diào)節(jié)作用的重要機(jī)