1、抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝1. 青霉素發(fā)酵工藝的建立對抗生素工業(yè)有何意義？青霉素是發(fā)現(xiàn)最早，最卓越的一種B-內(nèi)酰胺類抗生素，它是抗生素工業(yè)的首要產(chǎn)品， 青霉素是各種半合成抗生素的原料。青霉素的缺點是對酸不穩(wěn)定，不能口服，排泄快，對革蘭氏陰性菌無效。青霉素經(jīng)過擴環(huán)后，形成頭孢菌素母核，成為半合成頭孢菌素的原料。2. 如何根據(jù)青霉素生產(chǎn)菌特性進行發(fā)酵過程控制？青霉素在深層培養(yǎng)條件下，經(jīng)歷 7 個不同的時期，每個時期有其菌體形態(tài)特性，在規(guī)定時間取樣，通過顯鏡檢查這些形態(tài)變化，用于工程控制。第一期：分生孢子萌發(fā)，形成芽管，原生質(zhì)未分化，具有小泡。第二期：菌絲繁殖，原生質(zhì)體具有嗜堿性，類脂肪小顆粒。第三期：形成

2、脂肪包含體，積累儲蓄物，沒有空洞，嗜堿性很強。第四期：脂肪包含體形成小滴并減少，中小空泡，原生質(zhì)體嗜堿性減弱，開始產(chǎn)生抗生素。第五期：形成大空泡，有中性染色大顆粒，菌絲呈桶狀。脂肪包含體消失，青差圭缶口七日言霉素產(chǎn)量提高。第六期： 出現(xiàn)個別自溶細胞，細胞內(nèi)無顆粒，仍然桶狀，釋放游離氨，pH 上升。第七期：菌絲完全自溶，僅有空細胞壁。一到四期為菌絲生長期，三期的菌體適宜為種子。四到五期為生產(chǎn)期，生產(chǎn)能力最強，通過工藝措施，延長此期，獲得高產(chǎn)。在第六期到來之前發(fā)束發(fā)酵。3. 青霉素發(fā)酵工程的控制原理及其關鍵點是什么？控制原理：發(fā)酵過程需連續(xù)流加葡萄糖，硫酸銨以及前提物質(zhì)苯乙酸鹽，補糖率是最關鍵的控

3、制指標，不同時期分段控制。在青霉素的生產(chǎn)中，及時調(diào)節(jié)各個因素減少對產(chǎn)量的影響，如培養(yǎng)基，補充碳源，氮源， 無機鹽流加控制，添加前體等；控制適宜的溫度和ph,菌體濃度。最后要注意消沫，影響呼吸代謝。4. 青霉素提煉工藝中采用了哪些單元操作？青霉素不穩(wěn)定，發(fā)酵液預處理、提取和精制過程要條件溫和、快速， 防止降解。提煉工藝包括如下單元操作：預處理與過濾：在于濃縮青霉素，除去大部分雜質(zhì)，改變發(fā)酵液的流變學特征，便于后續(xù)的分離純化過程。萃取：其原理是青霉素游離酸易溶于有機溶劑，而青霉素易溶于水。脫色：萃取液中添加活性炭，除去色素，熱源，過濾，除去活性炭。結(jié)晶：青霉素鉀鹽在乙酸丁酯中溶解度很小，在乙酸丁酯

4、萃取液中加入乙酸鉀 - 乙醇溶液，青霉素鉀鹽可直接結(jié)晶析出。氨基酸發(fā)酵工藝1. 如何對谷氨酸發(fā)酵工藝過程進行調(diào)控？發(fā)酵過程流加鏤鹽、尿素、氨水等氮源，補充NH+;生物素適量控制在2-5醫(yī)g/L ； pH 控制在中性或微堿性；供氧充足；磷酸鹽適量。2. 氨基酸生產(chǎn)菌有什么特性，為什么？L- 谷氨酸發(fā)酵微生物的優(yōu)良菌株多在棒狀桿菌屬、小短桿菌屬、節(jié)桿菌屬和短桿菌屬中。具有下述共同特性：細胞形態(tài)為短桿至棒狀；無鞭毛，不運動；不形成芽孢；革蘭氏陽性；生物素缺陷型；三羧酸循環(huán)、戊糖磷酸途徑突變；在通氣培養(yǎng)條件下產(chǎn)生大量L- 谷氨酸。3. 生物素在谷氨酸發(fā)酵過程中的作用是什么？生物素是不飽和脂肪酸合成過程

5、中所需的乙酰CoA的輔酶。生物素缺陷型菌種因不能合成生物素，從而抑制了不飽和脂肪酸的合成。而不飽和脂肪酸是磷脂的組 成成分之一。因此，磷脂的合成量也相應減少，這就會導致細胞膜結(jié)構不完整，提高細胞膜對谷氨酸的通透性，解除其對谷氨酸脫氫酶的抑制，源源不斷生產(chǎn)谷氨酸。維生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝1. 比較分析現(xiàn)行維生素C 的兩種生產(chǎn)工藝過程及本質(zhì)區(qū)別，有什么優(yōu)勢？現(xiàn)行的維生素c 生產(chǎn)工藝過程有：萊氏化學合成法和兩步發(fā)酵法。萊氏化學合成法：D-葡萄糖為原料，進過催化氫化生成 D-山梨醇，然后生物氧 化轉(zhuǎn)變?yōu)長-山梨糖，酸性液中丙酮化，對a - B-二仲醇進行保護。L-山梨糖高鎰酸 鉀在堿性溶液中氧化為二丙酮-2

6、- 酮 -L- 古龍酸， 除去丙酮，內(nèi)酯化和烯醇化得到L-抗壞血酸。整個合成過程必須保持第4 位碳原子的構型不變。兩部發(fā)酵法：催化氫化：催化氫化D-葡萄糖，控制壓力，在氫做還原劑、螺做催化劑的條件下，將醛基還原成醇基，從而制備D-山梨醇。第一部發(fā)酵：D-山梨醇C2位羥基氧化為撅基，其他基團不變，微生物轉(zhuǎn)化得L-山梨糖。第二部發(fā)酵：L-山梨糖到2-酮基-L-古龍酸需要將C1位醇基氧化為竣基，保持其他基團不 發(fā)生變化。其中兩步發(fā)酵法更具有優(yōu)勢。原因如下：以生物氧化代替化學氧化簡化了生 產(chǎn)工藝。省略了丙酮化反應步驟，節(jié)省了丙酮、硫酸等大量化工原料和其防爆設 備，節(jié)約了成本，有利于安全生產(chǎn)。三廢和污染

7、較小。提高了生產(chǎn)能力。2. 維生素C的生產(chǎn)工藝中，手性中心是如何實現(xiàn)的？維生素 C 分子中含有兩個手性碳原子，故有四個光學異構體。其中L(+)- 抗壞血酸括性最高，D( - ) -異抗壞血酸活性僅為其20，工業(yè)上將其作為食品抗氧劑。D(-)- 抗壞血酸和L(+)- 異抗壞血酸幾乎無活性。3. 在未來，一步發(fā)酵能取代兩部發(fā)酵，成為維生素生產(chǎn)的主流工藝嗎，為什么？/ 糖旁路代謝途徑進行敲除。與原始菌株比較，發(fā)現(xiàn)單菌發(fā)酵24h后，培養(yǎng)基中剩余的山梨醇糖含量基本保持恒定，NSR缺失株相對于原始菌株殘?zhí)橇刻岣吡?。基因工程制藥工藝1. 工程菌與宿主菌對培養(yǎng)基要求有何不同，為什么？碳源：大腸桿菌以蛋白胨等

8、蛋白質(zhì)的降解物作為碳源；酵母利用葡萄糖、半乳糖等單糖類物質(zhì)為碳源。氮源：不同工程菌對氮源利用能力差異大，具有很高的選擇性。大腸桿菌利用酵母粉等大分子有機氮源；酵母利用氨基酸為氮源。選擇劑：基因工程大腸桿菌含有抗生素抗性基因，抗生素作為選擇劑；基因工程酵母菌常用氨基酸營養(yǎng)缺陷型。2. 影響工程菌培養(yǎng)工藝的主要參數(shù)是什么？如何優(yōu)化控制？溫度：生長與生產(chǎn)溫度不一致。較高溫度表達量大，易形成包涵體。策略：較低溫度下有利于表達可溶性蛋白質(zhì)。對于熱敏感的蛋白質(zhì)，高溫會降解破壞。策略：生產(chǎn)期可采用先高溫，然后低溫，變溫表達，避免蛋白質(zhì)降解。pH: 了解發(fā)酵過程中各個階段的適宜 pH以后，進一步設法控制 pH

9、在合適的范 圍內(nèi)。 分階段控制pH:根據(jù)試驗結(jié)果來確定生長最適 pH和產(chǎn)物最適pH,以達到 最佳生產(chǎn)。溶解氧：從供應量和需要量（菌體生長、質(zhì)粒穩(wěn)定性、產(chǎn)物積累）二個方面考慮，使之需氧不超過設備的供氧能力，在臨界溶解氧濃度之上。3. 誘導物對生長和產(chǎn)物合成有何影響，為什么？誘導物用來誘導表達型工程菌。在細胞生長到一定階段，必需添加誘導物，以解除目標基因的抑制狀態(tài)，活化基因，進行轉(zhuǎn)錄和翻譯，生成產(chǎn)物。適宜的誘導時間非常重要。誘導物的濃度及其發(fā)酵溫度會影響表達量和產(chǎn)物存在形式。化學誘導型啟動子：lzc、tac、T7等，誘導時間為對數(shù)生長期。溫度誘導型啟動子：Pl、昧等，誘導時間為對數(shù)期或稍后一些。基

10、因工程制藥工藝1. 什么是基因工程菌，工程菌構建的基本過程和各階段的主要任務是什么，所涉 及基因工程原理是什么？將目的基因?qū)爰毦w內(nèi)使其表達，產(chǎn)生所需要的蛋白的細菌稱為基因工程菌。工程菌構建的基本過程如下：目標基因克隆（ PCR文庫篩選、化學合成）”表達 載體構建（酶切、鏈接）“遺傳轉(zhuǎn)化與篩選（外源基因?qū)肱c培養(yǎng)）”工程菌（獲 得新形狀、功能、產(chǎn)生物質(zhì)）酶切：在特異位點上催化雙鏈 DNA#子的斷裂，產(chǎn)生相應的限制性片段。（DNA+ 緩沖液+限制性內(nèi)切酶；37C, 1小時；加熱、加EDT聯(lián)止；電泳檢查酶切完整性）鏈接：DNAX鏈上相鄰的3'羥基和5'磷酸基團共價結(jié)合形成 3&#

11、39; -5'磷酸二 酯鍵，使原來斷開的 DNA缺口重新連接起來。（載體片段和基因片段，緩沖液，連 接酶；16-26 ，數(shù)小時；70加熱10min 終止反應）轉(zhuǎn)化： 把外源基因?qū)胨拗骷毎倪^程。（氯化鈣法向大腸桿菌導入外源基因）2. 目標基因克隆的主要方法有哪些？分析其特點及其適用范圍PCRT增。優(yōu)點：簡便快速，高效，數(shù)kb單基因克隆。缺點：DN課合酶活性和保真性限制。（94變性“ 55 c退火f 72 c延伸f 94 c變性）文庫篩選。優(yōu)點：長片段，無堿基錯誤，位置序列基因克隆。缺點：繁瑣，過程復雜，耗時，昂貴。化學合成：簡便，準確，已知序列基因克隆，引物合成。缺點：受合成儀性能限

12、制，長度很短。3. 大腸桿菌中高效表達蛋白藥物著重設計哪幾個方面？為了確保工程菌構建的有效性，必須遵循GM吸其有關生物制品研究技術指導原則， 做好菌種的記錄和管理。表達載體，詳細記錄表達載體，包括基因的來源、克隆和鑒定，表達載體的構建、結(jié)構和遺傳特性。宿主細胞：詳細記錄宿主細胞的資料，包括細胞株系名稱、來源、傳代歷史、鑒定結(jié)果及基本生物學特性等。 目標基因序列: 目標基因的序列包括插入基因和表達載體兩端控制區(qū)的核苷酸序列，以及所有與表達有關的序列，做到序列清楚。重組人干擾素生產(chǎn)工藝1. 重組人干擾素生產(chǎn)工藝路線有哪幾條，有何缺點？體外誘生干擾素制備工藝：仙臺病毒誘導人白細胞：血漿“人白細胞（病

13、毒 誘導）“分離純化"人白干擾素。 缺點：產(chǎn)量低，1g IFNa需要105L人血白細胞， 來源困難，工藝復雜，收率低，價格昂貴，潛在的血源性病毒污染的可能性。Namalva細胞培養(yǎng)（病毒培養(yǎng)）“合成干擾素“分離純化”多壓型混合干擾 素。優(yōu)點：首次實現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)，用細胞培養(yǎng)8000L。缺點：活性低，退出臨床應用。工程菌構建“發(fā)酵培養(yǎng)-包涵體“復性”重組人干擾素。工藝特點：發(fā)酵過程，隨后變性、復性過程。缺點：生物合成、純化及制劑階段均使用了一些動物或人血液提取成分，仍然沒有擺脫潛在的傳播血源性疾病的危險。工程C H O細胞系構建“細胞培養(yǎng)”收集培養(yǎng)液“分離純化”重組人干擾素。 工藝

14、特點：分泌表達，產(chǎn)量低， 成本高， 過程控制嚴格。可以做到無血清培養(yǎng)。基因工程假單胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝。工藝特點：發(fā)酵周期短：幾個小時，無需變性、復性過程，獲得有活性產(chǎn)品，純化過程：淘汰抗體親和層析，制劑中采用非人血清白蛋白新型保護劑，使得整個制造過程中不使用任何血液提取成分。2. 重組人干擾素發(fā)酵工段的關鍵控制點是什么，如何實現(xiàn)最優(yōu)化過程控制？搖瓶培養(yǎng)：搖瓶培養(yǎng)：30C, , 250rpm, 16-20h ;種子罐培養(yǎng)：接種：接入50L種子罐，接種量10%f養(yǎng)：30 C,控制：級聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速。3. 干擾素純化工藝的原理是什么？基于蛋白質(zhì)的電荷性除去雜質(zhì)，準確控制緩沖液和上樣液的pH

15、及電導值，純化干擾素4. 干擾素純化工藝過程中各工段的目的是什么？溶解粗干擾素：配置緩沖液（超純水，磷酸緩沖液，d m濾器和10ku超濾系統(tǒng)，百級層流下收集），冷卻至2-10 。在均漿器中完全溶解粗干擾素。等點沉淀與疏水層析：磷酸調(diào)節(jié)至，沉淀雜蛋白，離心收集上清液（含有人干擾素）。用NaOHM節(jié)上清7并用5MNaCl調(diào)節(jié)溶液電導值180ms/cm,上樣，進行疏水層析，利用干擾素的疏水性進行吸附。在 2-10 下， 用磷酸緩沖液（）+ NaCl進行洗滌，除去非疏水性蛋白。用磷酸緩沖液（） 進行洗脫，收集洗脫液，干擾素。或等電點沉淀與鹽析：磷酸調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)電導值 40 ms/cm, 2-10

16、76;C靜置過夜，除雜蛋白。1000ku 超濾膜過濾，除去大蛋白。調(diào)整溶液，10ku 超濾膜，緩沖液。陰離子交換層析與濃縮：磷酸緩沖液（） 平衡樹脂，鹽濃度線性梯度550ms/cm進行洗脫，2-10 C,配合SDS-PAGE攵集干擾素峰。把目標微分合并，調(diào)整溶液pH和電導值，10ku 超濾膜，醋酸緩沖液（）中透析。陽離子交換層析與濃縮：用醋酸緩沖液（）平衡樹脂。上樣，相同緩沖液沖洗。鹽濃度線性梯度 5-50ms/cm進行洗脫，配合 SDS-PAGE攵集干擾素峰。合并儲分， 10ku 超濾膜系統(tǒng)。凝膠過濾層析：NaCl 的磷酸緩沖液（）清洗系統(tǒng)和樹脂。上樣，相同洗脫液進行洗脫。合并干擾素部分。無

17、菌過濾分裝：dm膜過濾干擾素溶液，分裝，-20 C以下的冰箱中保存。動物細胞培養(yǎng)制藥工藝1. 離體動物細胞對葡萄糖和谷氨酰胺的代謝特征是什么？蛋白質(zhì)的合成、修飾、分泌功能與制藥有何關系？葡萄糖代謝：糖酵解為主，生成丙酮酸和乳酸。丙酮酸經(jīng)TCA循環(huán)，氧化產(chǎn)生CO和水，釋放能量。葡萄糖一小部分進入PPP1徑，生成4、5、7碳糖和NADPH谷氨酰胺：作為氮源，轉(zhuǎn)氨、脫氨（為主），合成非必需氨基酸。大多數(shù)谷氨酰胺通過脫氨生成谷氨酸，并釋放銨離子。小部分谷氨酰胺通過轉(zhuǎn)氨生成其他嘌呤、嘧啶和氨基糖等合成代謝的前體。氨基酸在粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體上，以mRNA；模板，進行密碼翻譯，生成蛋白質(zhì)的多肽鏈。在粗糙內(nèi)

18、質(zhì)網(wǎng)腔和高爾基體內(nèi)加工修飾形成糖基化蛋白質(zhì)。糖基結(jié)構易變化，不同細胞系糖基化特征不同，要根據(jù)藥物的結(jié)構選擇適宜細胞系。2. 制藥動物細胞系的種類和特點有哪些？有限細胞系：是生長和壽命有限的細胞，經(jīng)過若干傳代培養(yǎng)后失去增殖能力，老化死亡。有限生長，無致瘤性，有接觸抑制性。壽命取決于細胞來源的物種和年齡、器官。胚成纖維細胞人（50 代） ，雞胚（30 代） ，小鼠（8 代）無限細胞系：壽命和活性不受傳代次數(shù)影響的細胞系，可連續(xù)培養(yǎng)。也稱為永久細胞系或連續(xù)細胞系。沒有接觸抑制現(xiàn)象，對培養(yǎng)條件和營養(yǎng)因子等要求低，倍增時間短，非常適合于制藥工業(yè)生產(chǎn)。人源細胞系：Namalwa， WI-38， MRC-5

19、哺乳動物細胞系：CHO貼壁或懸浮培養(yǎng)，對剪切力和滲透壓有較高的忍受能力。BHK-21， C127， Vero雜交瘤細胞系：脾臟B細胞與骨髓瘤細胞通過原生質(zhì)體融合，獲得的雜交細胞。無血清培養(yǎng)，高密度懸浮生長，容易轉(zhuǎn)染和生長，大量分泌和高效表達3. 與大腸桿菌和酵母系統(tǒng)相比，哺乳動物源細胞系統(tǒng)制藥的優(yōu)缺點，如何選擇？CHO®胞：Chinese hamster ovary ,中國倉鼠卵巢，亞二倍體核型，2n=22。特點：貼壁型生長，也可懸浮培養(yǎng)，對剪切力和滲透壓有較高的忍受能力。最為普遍和成熟表達糖基化蛋白藥物的細胞。多種衍生突變株，高表達。BHK-21 細胞：成纖維樣細胞，非整倍體，2n

20、=44. 用于增殖病毒、制備疫苗和重組蛋白。C127細胞，貼壁生長，適合于牛乳頭病毒DNA®體的轉(zhuǎn)化。Vero 細胞： 多倍體核型，貼壁依賴性。Vero6 最為常用，增至病毒，生產(chǎn)疫苗。4. 工程動物細胞系的建立：基本過程，表達載體設計，轉(zhuǎn)化與培養(yǎng)方案篩選和鑒定方法。它們與基因工程微生物的異同是什么？5. 動物細胞培養(yǎng)基組成成分及其作用是什么？與微生物培養(yǎng)基培養(yǎng)基相比，有何特殊性？動物細胞培養(yǎng)基的成分主要有糖類、氨基酸、維生素與無機鹽、激素及附加成分。作用：糖類提供細胞生長的碳源和能源。分解后釋放出能量ATR氨基酸可通過生糖或生酮途徑轉(zhuǎn)變?yōu)樘腔蛑舅幔g接提供能量。維生素既不是細胞的

21、物質(zhì)基礎，也不是能量物質(zhì)，對代謝和生長起調(diào)節(jié)和控制作用。無機鹽是細胞代謝所需酶的輔基，同時保持細胞的滲透壓和緩沖 PH的變化。激素對細胞的生長有刺激作用。貼附因子的作用是讓細胞的貼壁生長。6. 生產(chǎn)用最適動物細胞培養(yǎng)基應該選擇哪種，為什么？合成培養(yǎng)基，組分穩(wěn)定，容易配置。已有幾十種合成培養(yǎng)基，大部分已商品化7. 如何控制動物細胞培養(yǎng)基的質(zhì)量？培養(yǎng)用水質(zhì)：必須按照 GMf求進行制備，除去普通水中的各類元素、有毒或有害物質(zhì)及微生物和熱源，達到純水標準。緩沖液：KCG/NaCHO; NaHPO/NazHPO;恒定 pH。平衡鹽溶液：BBS由NaCl、無機鹽和葡萄糖、緩沖劑、指示劑組成。滿足細胞對鹽離

22、子、碳營養(yǎng)要求；pH和滲透壓要求；直觀觀察 pK磷酸鹽緩沖液：PBS KCl、KHPO、NaCl、NaHPQ培養(yǎng)物、器皿的洗滌液。氨基酸配置：50倍濃縮液。使用L型氨基酸，對于 DL混合型氨基酸，使用量應該加倍。谷氨酰胺不穩(wěn)定，需單獨配置（100 倍濃縮液，-20 保存） 。8. 基質(zhì)依賴性與非依賴性細胞系對培養(yǎng)條件的要求有什么不同？如何滿足？貼壁依賴性細胞：依賴于生長基質(zhì)，并在表面才能生長的細胞。只能貼壁生長。多數(shù)天然細胞。非貼壁依賴性細胞：不依賴于生長基質(zhì)，可懸浮生長。淋巴細胞、雜交瘤細胞、腫瘤細胞。生長基質(zhì)：改變介質(zhì)表面特性，支撐、促進動物細胞貼附的物質(zhì)。為支持介質(zhì)表面提供適量帶正電荷，

23、細胞被吸附在介質(zhì)上。9. 細胞大規(guī)模培養(yǎng)有幾種方法，有何特點，如何選擇應用？單層貼壁培養(yǎng)。單層貼壁培養(yǎng)是指把細胞貼附于一定的固體支持表面上，生長形成單層細胞的培養(yǎng)方法，適合于貼壁依賴性細胞培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)是指細胞在細胞反應器內(nèi)游離懸浮生長的培養(yǎng)過程，主要對于非貼壁性依賴性細胞，如雜交瘤細胞。微囊培養(yǎng)。把動物細胞包埋在微載體內(nèi)或膠囊內(nèi)固定化后，進行懸浮培養(yǎng)，適合于貼壁依賴性和非貼壁依賴性細胞。微載體培養(yǎng)。微載體是三維培養(yǎng)系統(tǒng)，有很大的比表面積，細胞貼附于載體上增值，再懸浮于細胞液中，兼具有貼壁和懸浮培養(yǎng)的雙重優(yōu)點10.比較微生物發(fā)酵控制過程的異同動物細胞微生物溫度在線，恒溫，水套層，電熱

24、片， 加溫二基點，發(fā)酵熱對生長和生廣影響， 變溫控制，降溫攪拌，泡沫低轉(zhuǎn)速，加剪切保護劑，消沫劑基于供氧與混合，化學消沫劑與分散 齊IJ,機械消沫溶解氧臨界氧濃度供氧與耗氧的平衡，臨界氧濃度之上CO需要通入，調(diào)下pH尾氣，呼吸強度pH恒定，緩沖劑，通氣，補料，綜 合控制二基點，變pH,加酸/堿；緩沖劑， 補料代謝檢測與分析底物消耗，副產(chǎn)物生成，胞內(nèi)代 謝，分泌底物消耗，產(chǎn)物的生成，生物化學變 化補料補充營養(yǎng)，控制代謝過程解除底物抑制，增加前體放料解除副廣物，收獲產(chǎn)物解除產(chǎn)物抑制重組人紅細胞生成素的生產(chǎn)工藝1. 比較各種表達系統(tǒng)生產(chǎn)rhEPO的優(yōu)缺點。SV40病毒啟動子的表達載體，在 COS-1

25、中瞬時表達hEPO昆蟲SF9細胞中桿狀病毒載體表達rhEPO。產(chǎn)率有所改善，糖基化程度較小家蠶系統(tǒng)表達，糖基化簡單，藥物在體內(nèi)穩(wěn)定性較低、活性較差等問題。大腸桿菌表達，僅具體外抗原結(jié)合活性。干擾素-a基因啟動子的rhEPO表達載體，BALL-1細胞，產(chǎn)生較高量的rhEPO。CHO BHKffl胞中穩(wěn)定表達，rhEPO與天然EPO吉構、活性相似。2. CHO培養(yǎng)生產(chǎn)rhEPO的基本工藝過程及其控制點是什么，為什么？復蘇：液氮凍存的 CHOffl胞系在37c中水浴快速融化。無菌離心，棄上清。培養(yǎng)：加適量 DMEM10%、牛血清），37C、CO縮養(yǎng)箱培養(yǎng)，連續(xù)傳三代。消化：用胰蛋白酶消化貼壁細胞后，

26、制成細胞濃度約為X106個/ml。用于接反應器滅菌：加纖維素載體片及的PBS緩沖液，高壓滅菌接種：排出PBS沖液，加DME雌養(yǎng)基（含10%血清），接入種子細胞c貼壁培養(yǎng)：pH7， <50r/min ， 37，DO50-80%。擴增培養(yǎng)：80 100r/min 。 pH7， 37。灌流培養(yǎng)：控制溫度、DO pH值等培養(yǎng)條件，進行無血清培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)。收獲培養(yǎng)物：連續(xù)收獲，4 C 8 c保存。控制點：攪拌控制：接種后，攪拌速度緩慢，使細胞貼附于載體上，隨著細胞數(shù)量的增加逐漸提高攪拌速度。溫度控制：較為嚴格，恒定 37 cpH值控制：輸入CO開口碳酸氫鹽溶液維持其恒定。溶解氧控制：在 50-8

27、0 %的范圍內(nèi)，通入氧氣、空氣、氫氣或氮氣的比例混合氣體。葡萄糖控制：流加補料代謝廢物控制：監(jiān)測鏤、乳酸鹽類等，維持較低濃度，減少對細胞損害。3. rhEPO 分離純化工藝中使用了哪些操作單元，為什么？收獲培養(yǎng)液、透析、過濾、DEA離子交換、凝膠過濾。三廢處理工藝1. 簡述制藥企業(yè)清潔生產(chǎn)的途徑資源綜合利用一一原料資源的綜合利用、水資源的綜合利用、二次資源綜合利用、廢物綜合利用；改革工藝和裝備一一原料處理工藝的改革、產(chǎn)品制造工藝的全過程統(tǒng)籌、裝備技術的更新；改進操作和加強管理；必要的末端處理。2. 簡述制藥工業(yè)的末端污染特點制藥廠排出的污染物通常具有毒性、刺激性和腐蝕性。化學制藥廠的污染物還具

28、有數(shù)量少、組分多、變化大、間歇排放、pH不穩(wěn)定、CODE等特點。這些特點與防治措施的選擇有直接關系。3. 制藥廢水分為哪幾種類型？有何特點？如何治理？含懸浮物或膠體的廢水。廢水中所含的懸浮物一般可通過沉淀、過濾或氣浮等方法除去。是廢水的常規(guī)預處理程序。氣浮法的原理：利用高度分散的微小氣泡作為載體去粘附廢水中的懸浮物，使其密度小于水（ 相對密度<1）而上浮到水面，從而實現(xiàn)固液分離。對于懸浮物質(zhì)：用沉淀、 氣浮、 過濾等方法去除。對于樹脂狀物：由于不易上浮和沉淀，須采用輔助手段（如通入壓縮空氣、直接蒸汽加熱、加入無機鹽等）使懸浮物聚集起來沉淀或氣浮分離。對于極小膠體：可用混凝法或吸附法處理。含酸堿性廢水。化學制藥過程中常排出各種含酸或堿的廢水，其中以酸性廢水居多。含酸濃度高的廢水應考慮盡量回收利用及綜合利用，如利用廢硫酸制作磷肥等。含酸（堿）1%以下而沒有經(jīng)濟價值的廢水經(jīng)中和后才能排放，以免腐蝕排水管道，危害水中生物。中和時，盡量采用廢堿或廢酸，也可考慮用氨水中和，然后用于灌溉。若中和后的廢水水質(zhì)符合國家規(guī)定的排放標準，可直