1、硫苷脂和燒傷后血清刺激大鼠中性粒細胞產生活性氧摘要目的：研究L-選擇素配體硫苷脂和燒傷后血清對大鼠中性粒細胞產生活性氧的影響。方法：分別用硫苷脂、燒傷后血清、燒傷后血清加硫苷脂刺激分離的大鼠中性粒細胞，用細胞色素C法測定細胞培養液中超氧陰離子濃度，用熒光物質東莨菪苷原測定細胞產生過氧化氫濃度，用熒光探針Fura-2/AM測定胞內游離鈣濃度。結果：硫苷脂、燒傷后血清刺激后，細胞產生的超氧陰離子、過氧化氫和胞內鈣離子濃度度均明顯增加，燒傷后血清刺激后再用硫苷脂刺激，三者的濃度不再增加。結論：硫苷脂、燒傷后血清可能通過鈣信號傳導而使中性粒細胞產生活性氧增加，引起細胞的某些功能改變。主題詞燒傷； 中性

2、白細胞； 氧；鈣中分類號R644.02文獻標識碼A文章編號1000-4718(2000)08-0721-02MeSHBurns; Neutrophils; Oxygen; Calcium 嚴重燒傷可導致全身炎癥反應綜合癥的發生，白細胞粘附在全身炎癥反應綜合癥的發生發展中起重要作用。粘附分子選擇素介導白細胞粘附，同時它還是一信號分子1。選擇素的生物學作用中是否有活性氧參與，燒傷后的情況又是怎樣，目前尚不清楚。本研究利用分離的大鼠中性粒細胞，觀察L-選擇素配體硫苷脂和燒傷后血清對細胞培養液中活性氧產生和細胞內鈣離子濃度的影響，以了解L-選擇素在燒傷后中性粒細胞粘附中的作用。材料和方法一、中性粒細胞

3、分離用持續灌注法收集SD大鼠血細胞，即用30 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠后，仰臥位固定，經正中切口進胸，剪去部分前胸壁，充分暴露心臟，將IL冷PBS/EDTA(AMERSCO公司)灌洗液經左心室緩慢灌入，剪開右心室壁，使血液和灌洗液流出。收集胸腔中灌洗液，550 g離心10 min，去上清液。隨后用淋巴細胞分離液(上海華精生物高科技有限公司)分離大鼠中性粒細胞，該法獲得的細胞活力在97%以上(臺盼藍液法)，中性粒細胞約占88%2。分離的細胞保存在DMEM(Gibco公司)培養液中。二、大鼠燒傷后6 h血清制備SD大鼠用戊巴比妥鈉(30 mg/kg ip)麻醉，背部去毛，用恒溫水燙儀(

4、第二軍醫大學長海醫院燒傷中心研制)100水燙12 s，制成30% 度燒傷模型。在燒傷后6 h取血分離血清，56水浴30 min滅活補體，冰凍儲存，備用。三、實驗分組實驗分為5組：第1組，對照組，細胞不刺激；第2組，硫苷脂(400 g/100 L)刺激細胞；第3組，正常血清(100 L)刺激細胞；第4組，燒傷后6 h血清(100 L)刺激細胞；第5組，燒傷后6 h血清(100 L)刺激細胞后，硫苷脂(400 g/100 L)再刺激細胞。四、檢測用細胞色素C(Sigma公司)法測定細胞培養液中超氧陰離子濃度，細胞產生過氧化氫濃度檢測用熒光物質東莨菪苷原(Sigma公司)測定3。細胞內鈣離子濃度用熒

5、光探針Fura-2/AM(Calbiochem公司)檢測。五、統計處理結果用s表示，進行t檢驗。 結果硫苷脂刺激后細胞產生超氧陰離子和過氧化氫濃度非常明顯高于對照組(P0.01)。正常血清對細胞無刺激作用。燒傷后6 h血清刺激后，細胞產生的超氧陰離子和過氧化氫濃度非常明顯高于對照組(P0.01)，但在此基礎上再用硫苷脂刺激，產生的量不再增加，和單用燒傷后血清刺激組相比無明顯差異(P0.05，表1)。細胞在硫苷脂刺激后胞內鈣離子濃度明顯高于對照組(P0.01)。正常血清刺激不能使胞內鈣離子濃度增加，用燒傷后6 h血清刺激，胞內鈣離子濃度明顯增加(P0.01)。但燒傷后血清刺激后的細胞再用硫苷脂刺

6、激，鈣離子濃度不再明顯增加(P0.05，表1)。表1大鼠中性粒細胞產生的活性氧和胞內鈣離子濃度Tab 1 Alterations of the reactive oxygen and Ca2i in isolated rat neutrophils (n=5, s)GroupO?2(nmoles/1106 cells)H2O2(nmoles/1106 cells)Ca2+i(nmol/L)10.10.10.20.158.15.620.90.1*1.50.2*155.650.2*30.20.10.30.167.28.841.20.3*1.40.2*98.517.3*51.20.8*1.50.31

7、07.327.3* * P0.01, vs group 1; P0.01, vs group 3 討論反應性氧族和反應性氮族通過其分布在細胞外的配體，在調節細胞反應中起重要作用，許多學者將其作為信號分子。它們可參與細胞因子、生長因子、激素的作用和分泌；離子轉動；轉錄；神經調節和凋亡4。這可能與調節NF-B、激活蛋白(AP)-1有關。信號分子H2O2即可通過ERK與JNK/SAPK兩條途徑來傳導信號5。L-選擇素在血中性粒細胞、單核細胞、大多數T、B細胞及NK細胞的一亞群中有表達，它通過與分布在內皮細胞表面的配體結合，介導白細胞在血管內皮上的接觸和滾動；通過與白細胞上配體結合，介導白細胞間粘附；

8、并介導淋巴細胞歸巢。L-選擇素及配體PSG-1還能介導細胞的“內翻外”信號傳導1。實驗發現，硫苷脂使大鼠中性粒細胞產生的超氧陰離子、過氧化氫及胞內鈣離子濃度明顯增加。這提示，L-選擇素交聯能夠誘導細胞內信號(包括鈣離子釋放)，最終導致細胞活性氧產生增加。燒傷后血清中含有大量的炎癥介質和細胞因子，如PGE2、LTB4、IL-2、TNF、C1q，它們對機體有刺激作用。燒傷后血清能激活細胞NADPH氧化酶，使超氧陰離子和過氧化氫產生增加，細胞內鈣離子濃度也增加。燒傷后血清也能誘導細胞內信號，使活性氧產生增加。但燒傷后血清刺激后的PMN再用硫苷脂刺激，超氧陰離子、過氧化氫產量及胞內鈣離子濃度均不再明顯

9、增加。這可能是燒傷后血清刺激后，PMN表面的L-選擇素有脫落。這種脫落現象在激活或趨化因子如LPS、TNF-、PMA刺激后均發生，其具體機理不清，可能會促進隨后進行的中性粒細胞與內皮細胞緊密接觸時的粘附6。燒傷后體內的中性粒細胞有無L-選擇素脫落，燒傷后的中性粒細胞的信號傳導是否有L-選擇素參與，仍待進一步研究。基金項目 上海市醫學領先專業基金資助倪俊（解放軍85醫院， 上海 200052）于寶軍（第二軍醫大學長海醫院燒傷科）楊紅蓮（第二軍醫大學長征醫院外科）陳玉林（第二軍醫大學長海醫院燒傷科）郇京寧（第二軍醫大學長海醫院燒傷科）劉訓龍（解放軍85醫院， 上海 200052）參考文獻1倪俊，陳

10、玉林. 選擇素與創傷膿毒癥J. 國外醫學創傷與外科基本問題分冊， 1998， 19(3)： 133136.2丁自強，李少華，吳中立. 血小板激活抑制因子介導過氧化氫引起的白細胞-內皮細胞粘附J. 第二軍醫大學學報， 1992， 13(2)： 106110.3Waddell TK, Tialkow L, Chan CK, et al. Potentiation of the oxidative burst of human neutrophilJ. J Biol Chem, 1994, 269(28): 1848518490. 4Lander HM. An essential role for free radicals and derived species in signal transductionJ. FASEB J, 1997, 11(1): 118124.5Wang X, Martindale JL, Liu Y, et al. The cellular resonse to oxidative stress: influences of mitogenactivated protein kinase signalling pathways on cel