1、* *6 種方法測定蛋白質含量一、微量凱氏(kjeldahl)定氮法樣品與濃硫酸共熱。含氮有機物即分解產生氨(消化)，氨又與硫酸作用， 變成硫酸氨。經強堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據此酸液 被中和的程度可計算得樣品之氮含量。若以甘氨酸為例，其反應式如下：nh2ch2cooh+3h2so4 - 2co2+3so2+4h2o+nh32n h3+h2so4- (n h4)2so4 (2)(n h4)2so4+2 naoh- 2h2o+na2so4+2 nh3 (3)反應(1 )、(2)在凱氏瓶內完成，反應(3)在凱氏蒸餾裝置中進行。為了加速消化，可以加入 cuso4 作催化劑，k2

2、so4 以提高溶液的沸點。收 集氨可用硼酸溶液，滴定則用強酸。實驗和計算方法這里從略。計算所得結果為樣品總氮量，如欲求得樣品中蛋白含量，應將總氮量減去非蛋白氮即得。如欲進一步求得樣品中蛋白質的含量，即用樣品中蛋白氮乘以 6.25 即得。二、雙縮脲法(biuret法)(一)實驗原理雙縮脲(nh3conhconh3 )是兩個分子脲經 180 C 左右加熱，放出一個分子氨后得到的產物。在強堿性溶液中，雙縮脲與cuso4 形成紫色絡合物，稱為* *雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應。紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比， 而與蛋

3、白質分子量及氨基酸成 分無關，故可用來測定蛋白質含量。測定范圍為 1-10mg 蛋白質。干擾這一測 定的物質主要有：硫酸銨、tris 緩沖液和某些氨基酸等。此法的優點是較快速，不同的蛋白質產生顏色的深淺相近，以及干擾物質 少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精 確的蛋白質測定。（二） 試劑與器材1試劑：（1） 標準蛋白質溶液：用標準的結晶牛血清清蛋白（bsa）或標準酪蛋白， 配制成 10mg/ml 的標準蛋白溶液， 可用 bsa 濃度 1mg/ml 的 a280 為 0.66 來 校正其純度。如有需要，標準蛋白質還可預先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量， 計算出其

4、純度，再根據其純度，稱量配制成標準蛋白質溶液。牛血清清蛋白用h2o 或 0.9%nacl 配制，酪蛋白用 0. 05n naoh 配制。（2） 雙縮脲試劑：稱以 1.50 克硫酸銅（cuso4?5h2o ）和 6.0 克酒石酸鉀 鈉（knac4h4o6 ?4h2o ），用 500 毫升水溶解，在攪拌下加入 300 毫升 10% naoh 溶液，用水稀釋到 1 升，貯存于塑料瓶中（或內壁涂以石蠟的瓶中）。此試劑可 長期保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現，則需要重新配制。2.器材：* *可見光分光光度計、大試管 15 支、旋渦混合器等。（三） 操作方法1. 標準曲線的測定：取 12 支試管分兩組，分別

5、加入 0 , 0.2 , 0.4 , 0.6 ,0.8 , 1.0 毫升的標準蛋白質溶液，用水補足到1 毫升，然后加入 4 毫升雙縮脲試劑。充分搖勻后，在室溫（2025C）下放置 30 分鐘，于 540nm 處進行比 色測定。用未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照液。取兩組測定的平均值，以蛋白質的含量為橫座標，光吸收值為縱座標繪制標準曲線。2、 樣品的測定：取 23 個試管，用上述同樣的方法，測定未知樣品的蛋 白質濃度。注意樣品濃度不要超過 10mg/ml。三、folin酚試劑法（lowry法）（一）實驗原理這種蛋白質測定法是最靈敏的方法之一。 過去此法是應用最廣泛的一種方法， 由于其試劑乙

6、的配制較為困難（現在已可以訂購），近年來逐漸被考馬斯亮蘭法 所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即 folin 酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。這兩種顯色 反應產生深蘭色的原因是：在堿性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物。 folin 酚試劑中的磷鉬酸鹽一磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還 原，產生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的 量成正比。folin 酚試劑法最早由 lowry 確定了蛋白質濃度測定的基本步驟。以后在 生物化學領域得到廣泛的應用。這個測定法的優點是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏 得多，缺點

7、* *是費時間較長，要精確控制操作時間，標準曲線也不是嚴格的直線形 式，且專一性較差，干擾物質較多。對雙縮脲反應發生干擾的離子，同樣容易干擾 lowry 反應。而且對后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、tris 緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5% ），硫酸納（1%），硝酸納（1% ），三氯乙酸（0.5% ），乙醇（5%），乙醚（5%）， 丙酮（0.5% ）等溶液對顯色無影響，但這些物質濃度高時，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉一氫氧化鈉溶液，即可顯色測定。若樣品酸度 較高，顯色后會色淺，則必須提高碳酸鈉一氫氧化鈉溶液的濃度12 倍。進行測定

8、時，加 folin 酚試劑時要特別小心，因為該試劑僅在酸性ph 條件下穩定，但上述還原反應只在 ph=10 的情況下發生，故當 folin 一酚試劑加 到堿性的銅一蛋白質溶液中時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸一磷鎢酸試劑被 破壞之前，還原反應即能發生。此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。此法可檢測的最低蛋白質量達 5mg。通常測定范圍是 20250mg。（二）試劑與器材1試劑（1 ）試劑甲：（a） 10 克 na2co3 ,2 克 naoh 和 0.25 克酒石酸鉀鈉（knac4h4o6 ?4h2o ）。溶解于 500 毫升蒸餾水中。（b） 0.5 克硫酸銅（cuso4 ?5h2o ）溶解于

9、100 毫升蒸餾水中，每次使用* *前，將 50 份（a）與 1 份（b）混合，即為試劑甲。（2） 試劑乙： 在 2 升磨口回流瓶中， 加入 100 克鎢酸鈉 （na2wo4 ?2h2o ） ,25 克鉬酸鈉（na2moo4 ?2h2o ）及 700 毫升蒸餾水，再加 50 毫升 85%磷酸，100 毫升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流 10 小時，回流結束時，加入150 克硫酸 鋰（Ii2so4 ）, 50 毫升蒸餾水及數滴液體溴，開口繼續沸騰 15 分 鐘，以便驅除過量的溴。冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復滴加液體溴 的步驟）。稀釋至 1 升,過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。

10、使用時用標準 naoh 滴定，酚酞作指示劑，然后適當稀釋，約加水 1 倍，使最終的酸濃度為 1n 左右。（3）標準蛋白質溶液：精確稱取結晶牛血清清蛋白或 g球蛋白，溶于蒸 餾水，濃度為 250mg/ml 左右。牛血清清蛋白溶于水若混濁，可改用 0.9%nacl 溶液。2.器材（1） 可見光分光光度計（2） 旋渦混合器（3） 秒表（4） 試管 16 支（三）操作方法1.標準曲線的測定：取 16 支大試管，1 支作空白，3 支留作未知樣品，其 余試管分成兩組，分別加入 0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 毫升標準蛋白質 溶液（濃度為 250mg/ml ）。用水補足到 1.0 毫升，

11、然后每支試管加入 5 毫升 試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫（2025C）放置 10 分鐘。再逐管 加入 0.5 毫升試劑乙（folin 酚試劑），同樣立即混勻。這一步混合速度* *要快， 否則會使顯色程度減弱。然后在室溫下放置30 分鐘，以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照，于 700nm 處測定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質的量 為橫座標，吸光度值為縱座標，繪制出標準曲線* *注意：因 lowry 反應的顯色隨時間不斷加深，因此各項操作必須精確控制時 間，即第 1 支試管加入 5 毫升試劑甲后，開始計時，1 分鐘后，第 2 支試管加入 5 毫升試劑甲，2 分鐘后加第 3 支試管，

12、余此類推。全部試管加完試劑甲后若已 超過 10 分鐘，則第 1 支試管可立即加入 0.5 毫升試劑乙，1 分鐘后第 2 支試管 加入 0.5 毫升試劑乙，2分鐘后加第 3 支試管，余此類推。待最后一支試管加完 試劑后，再放置 30 分鐘，然后開始測定光吸收。每分鐘測一個樣品。進行多試管操作時，為了防止出錯，每位學生都必須在實驗記錄本上預先畫 好下面的表格。表中是每個試管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下 的順序，逐管加入。最下面兩排是計算出的每管中蛋白質的量（微克）和測得的 吸光度值。folin 酚試劑法實驗表5.05.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0

13、0.50.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5每管中蛋白質的量（mg）吸光度值（a700）管號123標準蛋白質00.145670.2 0.4 0.6 0.8 1.010（250mg/ml ）未知蛋白質0.2 0.4 0.6(約 250mg/ml )蒸餾水1.00.9 0.8 0.6 0.4 0.200.8 0.6 0.4試劑甲試劑乙* *2. 樣品的測定：取 1 毫升樣品溶液（其中約含蛋白質 20250 微克），按 上述方法進行操作，取 1 毫升蒸餾水代替樣品作為空白對照。 通常樣品的測定也 可與標準曲線的測定放在一起，同時進行。即在標準曲線測定的各試管后面，再

14、增加 3 個試管。如上表中的 & 9、10 試管。根據所測樣品的吸光度值，在標準曲線上查出相應的蛋白質量， 從而計算出 樣品溶液的蛋白質濃度。注意:由于各種蛋白質含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質而變化。因而本測定法通常只適用于測定蛋白質的相對濃度（相對于標準蛋白質）。四、改良的簡易folin酚試劑法（一） 試劑1.試劑甲：堿性銅試劑溶液中，含 0.5n naoh、10%na2co3、0.1%酒石 酸鉀和0.05%硫酸銅，配制時注意硫酸銅用少量蒸餾水溶解后， 最后加入。2試 劑乙：與前面的基本法相同。臨用時加蒸餾水稀釋 8 倍。3. 標準蛋白質溶液：同基本法。（

15、二） 操作步驟測定標準曲線與樣品溶液的操作方法與基本法相同。 只是試劑甲改為 1 毫升, 室溫放置 10 分鐘后，試劑乙改為 4 毫升。在 55C恒溫水浴中保溫 5 分鐘。用流動水冷卻后，在 660nm 下測定其吸光度值。* *改良的快速簡易法，可獲得與 folin 酚試劑法（即 lowry 基本法）相接近 的結果。五、考馬斯亮蘭法（bradford法）（一）實驗原理雙縮脲法（biuret 法）和 folin 酚試劑法（lowry 法）的明顯缺點和許多 限制，促使科學家們去尋找更好的蛋白質溶液測定的方法。1976 年由 bradford 建立的考馬斯亮蘭法（bradford 法），是根據蛋白質

16、 與染料相結合的原理設計的。這種蛋白質測定法具有超過其他幾種方法的突出優 點，因而正在得到廣泛的應用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質測定法。考馬斯亮蘭 g-250 染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的最大吸收 峰的位置（Imax），由 465nm 變為 595nm，溶液的顏色也由棕黑色變為蘭色。經研究認為，染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸 （特別是精氨酸）和芳香族氨 基酸殘基相結合。在 595nm 下測定的吸光度值 A595，與蛋白質濃度成正比。bradford 法的突出優點是：（1）靈敏度高，據估計比 lowry 法約高四倍，其最低蛋白質檢測量可達 1mg 這是因為蛋白質與染料結合后產

17、生的顏色變化很大， 蛋白質-染料復合物有更高 的消光系數，因而光吸收值隨蛋白質濃度的變化比 lowry 法要大的多。（2 ）測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要 5分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的過程，大約只要 2 分鐘即可完成，其顏色可 以在1 小時內保持穩定，且在 5 分鐘至 20 分鐘之間，顏色的穩定性最好。因而 完全不用像lowry 法那樣費時和嚴格地控制時間。（3）干擾物質少。如干擾 lowry 法的 k+、na+、mg2+離子、tris 緩沖液、 糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、edta 等均不干擾此測定法。* *此法的缺點是：（1） 由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香

18、族氨基酸的含量不同，因此 bradford法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差， 在制作標準曲線時通常選用 g球蛋白為標準蛋白質，以減少這方面的偏差。（2 ）仍有一些物質干擾此法的測定，主要的干擾物質有：去污劑、tritonx-100、十二烷基硫酸鈉（sds）和 0.1 n 的 naoh。（如同 0.1 n 的酸干擾 lowary 法一樣）。（3）標準曲線也有輕微的非線性，因而不能用beer 定律進行計算，而只能用標準曲線來測定未知蛋白質的濃度。（二）試劑與器材1. 試劑：（1 ） 標準蛋白質溶液， 用 g 球蛋白或 牛血清清蛋白（bsa） ， 配制成 1.0mg/ml和 0.1mg/ml 的標

19、準蛋白質溶液。（2） 考馬斯亮蘭 g 250 染料試劑：稱 100mg 考馬斯亮蘭 g 250，溶 于50ml 95%的乙醇后，再加入 120ml 85%的磷酸，用水稀釋至 1 升。2. 器材：（1） 可見光分光光度計（2） 旋渦混合器(3)試管 16 支(三)操作方法1.標準方法* *(1 )取 16 支試管，1 支作空白，3 支留作未知樣品，其余試管分為兩組按 表中順序，分別加入樣品、水和試劑，即用1.0mg/ml 的標準蛋白質溶液給各試管分別加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用無離子水 補充到0.1ml。最后各試管中分別加入 5.0ml 考馬斯亮

20、蘭 g 250 試劑，每加完 一管，立即在旋渦混合器上混合(注意不要太劇烈，以免產生大量氣泡而難于消 除)。未知樣品的加樣量見下表中的第 8、9、10 管。(2 )加完試劑 2-5 分鐘后，即可開始用比色皿，在分光光度計上測定各樣 品在595nm 處的光吸收值 a595，空白對照為第 1 號試管，即 0.1mlh2o 力卩 5.0mlg 250試劑。注意：不可使用石英比色皿(因不易洗去染色)，可用塑料或玻璃比色皿， 使用后立即用少量 95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或 丙酮長時間浸泡。考馬斯亮蘭法實驗表管號 12345678910標準蛋白質0 0.01 0.02 0.04

21、0.06 0.08 0.10(1.0mg/ml)未知蛋白質0.02 0.04 0.06(約 1.0mg/ml)蒸餾水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.0200.08 0.06 0.04考馬斯亮藍g 250 試劑 5.05.05.0 5.05.05.05.05.0* *5.05.0每管中的蛋白質量（mg ）光吸收值（a595）（3）用標準蛋白質量（mg ）為橫座標，用吸光度值 a595 為縱座標，作圖，即得到一條標準曲線。由此標準曲線，根據測出的未知樣品的 a595 值，即可查 出未知樣品的蛋白質含量。0.5mg 牛血清蛋白/ml 溶液的 a595 約為 0.50。2.微量法

22、當樣品中蛋白質濃度較稀時（10 100mg/ml ），可將取樣量（包括補加的 水）加大到 0.5ml 或 1.0ml,空白對照則分別為 0.5ml 或 1.0ml h2o,考馬斯亮 藍 g 250 試劑仍加 5.0ml,同時作相應的標準曲線，測定 595nm 的光吸收值。0.05mg 牛血清蛋白/ml 溶液的 a595 約為 0.29。六、紫外吸收法蛋白質分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環含有共軛雙鍵，使蛋白質具有吸收紫外光的性質。吸收高峰在280nm 處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質含量成正比。此外，蛋白質溶液在 238nm 的光吸收值與肽鍵含量成正 比。利用一定波長下，蛋白質溶液

23、的光吸收值與蛋白質濃度的正比關系，可以進行蛋白質含量的測定。紫外吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后仍能回收使用。低濃度 的鹽，* *例如生化制備中常用的（nh4）2so4 等和大多數緩沖液不干擾測定。特 別適用于柱層析洗脫液的快速連續檢測，因為此時只需測定蛋白質濃度的變化， 而不需知道其絕對值。此法的特點是測定蛋白質含量的準確度較差，干擾物質多，在用標準曲線法測定蛋白質含量時，對那些與標準蛋白質中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質， 有一定的誤差。故該法適于用測定與標準蛋白質氨基酸組成相似的蛋白質。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質， 會出現較大的干擾。核酸的干 擾可以通過查

24、校正表，再進行計算的方法，加以適當的校正。但是因為不同的蛋 白質和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經過校正，測定的結果還是存在一定的 誤差。此外，進行紫外吸收法測定時，由于蛋白質吸收高峰常因 ph 的改變而有變 化，因此要注意溶液的 ph 值，測定樣品時的 ph 要與測定標準曲線的 ph 相一 致。下面介紹四種紫外吸收法：1.280nm 的光吸收法因蛋白質分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在 280nm 處具有最大吸收， 且各種蛋白質的這三種氨基酸的含量差別不大，因此測定蛋白質溶液在 280nm 處的吸光度值是最常用的紫外吸收法。測定時，將待測蛋白質溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白質溶液的溶劑（水

25、 或緩沖液）作空白對照，在紫外分光度計上直接讀取 280nm 的吸光度值 a280。 蛋白質濃度可控制在 0.11.0mg/ml 左右。通常用 1cm 光徑的標準石英比色皿， 盛有濃度為1mg/ml 的蛋白質溶液時，a280 約為 1.0 左右。由此可立即計算出 蛋白質的大致濃度。許多蛋白質在一定濃度和一定波長下的光吸收值(al % 1cm )有文獻數據 可查，根* *據此光吸收值可以較準確地計算蛋白質濃度。下式列出了蛋白質濃度與(al % 1cm )值(即蛋白質溶液濃度為 1%，光徑為 1cm 時的光吸收值)的關 系。文獻值 a1 % 1cm,?稱為百分吸收系數或比吸收系數。蛋白質濃度 =(

26、a280 10 )/ a1 % 1cm,280nm (mg/ml)(q 1% 濃度?10mg/ml)例：牛血清清蛋白 ：a1 % 1cm=6.3 (280nm)溶菌酶： a1 % 1cm=22.8 (280nm)若查不到待測蛋白質的 a1 % 1cm 值，則可選用一種與待測蛋白質的酪氨酸 和色氨酸含量相近的蛋白質作為標準蛋白質，用標準曲線法進行測定。標準蛋白質溶液配制的濃度為 1.0mg/ml。常用的標準蛋白質為牛血清清蛋白(bsa)。標準曲線的測定：取 6 支試管，按下表編號并加入試劑：管號123456bsa (1.0mg/ml)01.02.03.04.05.0h2o5.04.03.02.0

27、1.00a280用第 1 管為空白對照，各管溶液混勻后在紫外分光光度計上測定吸光度a280，以 a280 為縱座標，各管的蛋白質濃度或蛋白質量(mg )為橫座標作圖，標準曲線應為直線，利用此標準曲線，根據測出的未知樣品的a280 值，即可查 出未知樣品的蛋白質含量，也可以用 2 至 6 管 a280 值與相應的試管中的蛋白質* *濃度計算出該蛋白質的 al % 1cm,280nm2. 280nm 和 260nm 的吸收差法核酸對紫外光有很強的吸收，在 280nm 處的吸收比蛋白質強 10 倍（每克）， 但核酸在 260nm 處的吸收更強，其吸收高峰在 260nm 附近。核酸 260nm 處 的

28、消光系數是 280nm 處的 2 倍，而蛋白質則相反，280nm 紫外吸收值大于 260nm 的吸收值。通常：純蛋白質的光吸收比值：a280/a260 ? 1.8純核酸的光吸收比值： a280/a260 ? 0.5含有核酸的蛋白質溶液，可分別測定其 a280 和 a260，由此吸收差值，用 下面的經驗公式，即可算出蛋白質的濃度。蛋白質濃度（mg/ml）=1.45Xa280 0.74Xa260此經驗公式是通過一系列已知不同濃度比例的蛋白質 （酵母烯醇化酶） 和核 酸 （酵母核酸）的混合液所測定的數據來建立的。3. 215nm 與 225nm 的吸收差法蛋白質的稀溶液由于含量低而不能使用 280nm 的光吸收測定時，可用215nm 與 225nm 吸收值之差，通過標準曲線法來測定蛋白質稀溶液的濃度。用已知濃度的標準蛋白質， 配制成 20100 mg/ml 的一系列 5.0ml 的蛋白 質溶液，分別測定 215nm 和 225nm 的吸光度值，并計算出吸收差：吸收差 d= a215 a225以吸收差 d 為縱座標，蛋白質濃度為橫座標，繪出標準曲線。再測出未