1、西南林業大學學術型碩士生學位論文開題報告基于兩種分子標記分析不同干擾硬葉兜蘭居群的遺傳多樣性AnalysisofgeneticdiversHyofPaphiopedilummicranthumindisturbedpopulationsbasedontwomolecularmarkers學號：20221104045姓名：張羅霞學科專業：園林植物與欣賞園藝研究方向：種質資源導師姓名：李宗艷職稱：副教授報.口主持人報告日期：填表日期：2022年10月13日題目:填表說明1、開題報告是碩士生培養的重要環節,研究生需在導師的指導下認真完成,具體要求參見?西南林業大學關于學術型研究生開題報告的規定202

2、2年修訂02、開題報告文獻綜述局部的根本要求：1國內外本研究課題的開展現狀、趨勢及問題等,字數3000字左右.2參考文獻量不少于20篇其中人文社科類不少于30篇,對于個別新興研究領域其文獻量可酌情減少.3文獻引用格式需符合?西南林業大學研究生學位論文格式的統一要求?的相關規定.3、完成時間：研究生開題工作應于入學后第三學期內完成,具體時間各學院可根據本學院的學科特點和實際情況進行安排.4、碩士生開題報告書應首先獲導師認可和考核小組成員審閱前方可參加開題.5、打印要求：此表用A4紙雙面打印,各欄空格不夠時,請自行加頁.6、開題報告通過、修改、簽字完畢后,交各學院存檔一份.選題根本情況,本研究題目

3、為：1.導師課題的一局部M；2,委培單位的課題；3.其它須具體說明選題分類M1.根底研究M2,應用研究3.綜合研究4.其他選題來源,2.國家社科規劃、基金工程4.國家自然科學基金工程6,省自治區、直轄市工程8,與港、澳、臺合作研究工程10.外資工程11.學校自選工程M12.國防工程13.非立項14.其他1.973、863工程3.教育部人文、社會科學研究工程5,中央、國家各部門工程7.國際合作研究工程9.企、事業單位委托工程一、立題依據1 .選題的理論和實踐意義兜蘭,又稱“女士拖鞋蘭、 “仙履蘭,是蘭科兜蘭屬(Paphiopedilum)植物的統稱.在拉丁語中,兜蘭的屬名Paphiopedilu

4、m由愛神Paphos和鞋子Pedilon組合而成,即愛神之鞋,以其唇瓣的形狀而得名.兜蘭是蘭科植物中最具特色的一個類群,也是最奇特的欣賞蘭花1,2.本屬植物的花形十分奇特,唇瓣呈兜狀,酷似舊時歐洲淑女的拖鞋；背萼特別興旺,具有艷麗的花紋.兜蘭以其獨特的花型而備受世界花卉愛好者的鐘愛3o近年來花卉產業開展迅速,而兜蘭做為蘭科欣賞價值最高的屬,深受廣闊消費者喜愛,人們對其需求量不斷增加,導致野生種質資源的大量采挖,造成野生種群數量的急劇減少,急需采取有效的保護舉措.我國產兜蘭屬植物18種,主要分布于西南地區,大多數的兜蘭種產于石灰巖地區的生境脆弱帶,盡管兜蘭屬植物具有克隆生長特性,但其生長緩慢,人

5、為過度利用產生野外小種群,導致種群地理隔離距離加大,種群基因流水平下降,種群空間遺傳多樣性變化.硬葉兜蘭(Paphiopedilummicranthum)和杏黃兜蘭(Paphiopedilumarmeniacum)是兜蘭屬植物采集壓力最大的種,對不同采集強度環境的種群的遺傳多樣性進行研究,為其保護提供根底依據.本研究以天然種群和人工干擾種群硬葉兜蘭種群的遺傳多樣性變異分析,通過對SSR和葉綠體間隔基因(psbA-trnH)技術比擬不同干擾程度種群內遺傳多樣性指數差異和種群內的遺傳分化水平,為今后干擾種群的保護舉措的采用提供分子依據.2 .文獻綜述國內外本研究領域的開展現狀、趨勢及問題等,并附參

6、考文獻2.1我國兜蘭屬植物的概況全世界約有兜蘭屬植物66種,近年來發表了10余個新種,總數增加到80余種4,主要分布于熱帶和亞熱帶地區,其中1/3以上分布于中國.其中云南、 廣西和貴州分布最多,全部種因其獨特的造型,繽紛的色彩讓研究者嘆為觀止,讓欣賞者賞心悅目.其中杏黃兜蘭和白花兜蘭2種為我國特產種.杏黃兜蘭和硬葉兜蘭被并稱為“金童玉女,是蘭花中的珍品,備受世人的關注.針對野生兜蘭受到掠奪性采挖和貿易而導致該類群植物迅速減少甚至滅絕的狀況,?華盛頓公約?即?瀕危野生動植物種國際貿易公約?,ConventiononInternationalTradeinEndangeredSpeciesofWi

7、ldFaunaandFlora,CITES把所有兜蘭屬植物列入其附錄一名錄,等同于大熊貓的保護等級,受到國際社會的嚴格保護.兜蘭屬植物大多分布于熱帶地區,不少種類喜生石灰巖山地,見于疏灌從中或林緣,性喜濕潤而溫暖的環境,但要預防陽光灼射和排水不暢.夏季要預防高溫,冬季不應低于12-15C.5.2.2分類學分子標記技術應用于蘭科植物的分類鑒定和品種鑒別,為蘭花的分類提供了分子水平的證據,也為蘭花保護策略和舉措的制定提供了理論根底.但至今為止,國內外用此技術研究兜蘭屬遺傳多樣性的報道并不多見.AntonyVCox等6應用核rDNA的ITS核甘酸序列數據,研究杓蘭屬、兜蘭屬、美洲兜蘭屬、碗蘭屬、墨西

8、哥蘭屬的150170個種之間的親緣關系,其中兜蘭屬的研究包括了中國兜蘭屬的15個原生種.研究認為sectionParvisepalum應從短瓣亞屬subgenusBrachypetalum中戈U出另立一亞屬subgenParvisepalum;而sectionCoryopedilum和sectionPardalopetalum應 歸 為 一 個 組sectionPardalopetalum.ITS樹狀圖明確了5個屬和各屬內種間的親緣關系,兜蘭屬的劃分與Cribb的傳統分類根本一致.國內也有應用分子標記的報道,孫彩云口曾利用RAPD口同工酶分子標記技術來分析中國兜蘭種間親緣關系.研究結果顯示,R

9、APD和同工酶兩種手段對種間親緣關系的劃分與傳統分類大致吻合,同工酶比RAPD的結果更接近傳統分類.兜蘭亞屬需進一步分組,彩云兜蘭、卷萼兜蘭、紫紋兜蘭及其變種云南虎皮應自成一個組,白花兜蘭和同色兜蘭的真正的分類學位置應如何確定尚需進一步研究.陳業網等通過對兜蘭屬植物ISSR-PCR反響體系的優化和對23種中國兜蘭屬植物親緣關系的ISSR分析,得出了比擬適合兜蘭屬植物ISSR反響體系.而23種中國兜蘭屬植物親緣關系的ISSR分析中得出：ISSR標記能夠準確的將23種中國兜蘭屬植物劃分為小萼亞屬、寬瓣亞屬和兜蘭亞屬3個亞屬,與劉仲健等的觀點一致,說明分子證據與形態特征是吻合的.朱亞艷等的利用SRA

10、小子標記對貴州南部地區8個野生兜蘭的遺傳多樣性進行分析,將不同來源野生兜蘭分為3組,研究顯示兜蘭基于SRAP分子標記的聚類分析與形態學分類結果一致.K.F.Rodrigues等11,實驗說明三個亞種群之間有有限的遷移和相當程度的種群之間的遺傳分化fit=0.5098暗示基因流動已經由于棲息地的分裂中斷.曾宋君12以3個群體30個同色兜蘭個體為材料對兜蘭引種繁殖雜交育種和SSR引物開發,研究說明,同色兜蘭同巨瓣兜蘭的遺傳距離較遠,文山兜蘭同巨瓣兜蘭的親緣關系較近.盧家仕等13通過對20份蘭科植物的ISSR遺傳多樣性分析,最后得出蘭屬與毛蘭屬親緣關系最近,兜蘭屬與蘭屬、毛蘭屬一起聚為一組,石斛屬與

11、其它3個屬的親緣關系相對較遠.2.3根底生物學2.3.1形態與細胞生物學唐漢耕司14對幾十種兜蘭進行了形態學的觀察和核型分析,并在此根底上進行了分類上的討論,將兜蘭屬劃分成六個亞屬.BraemGJ15對兜蘭屬的分類與唐漢耕司的基本一致.任玲等對兜蘭P.godefroyaeStein有性生殖全過程曾有過詳細的研究.結果說明兜蘭胚珠具一層珠被,胚囊發育為蔥型,胚乳具二核.種子成熟時胚柄及胚乳核都消失.成熟種子只具單層細胞的種皮和一個未分化的球形胚.單粒分散的花粉包裹于黃色粘性物質中.推測此粘液可能是花粉鞘類物質,它使得傳粉效率更高,但這種花粉團塊的結構在兜蘭屬中是否普遍,在蘭科植物系統發育上有何意

12、義,還需要進一步的比擬和觀察16.孫安慈17對蘭科植物的蘭屬、 兜蘭屬及石斛屬16個種的葉片及其橫斷面進行了掃描電鏡的觀察.觀察發現兜蘭屬的各個種上下表皮細胞均為多邊形,花葉類上表皮細胞外表明顯呈乳突狀,葉肉有分化；綠葉類呈龜背狀隆起,葉肉不分化.葉表皮細胞形狀、外表的突起和紋飾、葉肉分化與否等反映了各屬的特征.葉片形態結構特征也反映了各個種的生長習性,對生長環境的適應.因此,認為葉片的形態特征可以作為種、屬分類的參考.王英強8通過分析國產兜蘭屬植物的生態地理分布特點和開展趨勢,以及兜蘭屬植物系統演化趨勢與生態地理環境的關系,說明國產兜蘭主要分布于熱帶過渡地區南亞熱帶,主產于西南各省區；大多數

13、種類生長于石灰巖山地,多為半附生蘭,呈叢生生長.2.3.2繁殖生物學利用組織培養的方法進行大規模克隆繁殖,無疑可以減輕對野生兜蘭植物的采集壓力.由于兜蘭原生種的組織培養較難,雜交種的組織培養相對較易,因此利用雜交種進行組織培養是國外兜蘭商品化種苗生產的主要方式.兜蘭與大多數洋蘭一樣,由于種子的胚發育不完全,在自然狀況下需與真菌共生才有極少數的萌發.國內外對兜蘭菌根的研究開展緩慢.李明19曾采用根組織切片法從杏黃兜蘭根內別離到13株真菌,其中以鐮刀菌和組絲核菌為優勢菌.將組絲核菌JF74,JF75,JF80制成菌劑,施入杏黃兜蘭根部,對杏黃兜蘭產生了一定的促進生長的效果.但是鐮刀菌對杏黃兜蘭是有

14、益還是有害及其作用機理還待進一步研究.目前的組織培養研究著重于優化培養條件,如外植體的取材、培養基成分和激素的選擇試驗.研究發現用雜交種兜蘭的外植體誘導類原球莖較易獲得成功20-27,然而采用無菌種子萌發技術,已成功地獲得多種兜蘭的無性克隆個體28-31.武榮花陽等綜述了兜蘭屬植物擴繁研究主要集中于分株繁殖、組織培養、有菌播種以及無菌播種4個方面.目前,這些方面都取得了一些成果,特別是組織培養和無菌播種.現在人工栽培的兜蘭主要依靠分株進行繁殖,但是繁殖系數很低.隨著人口增長、環境變化、濫伐森林和耕地沙漠化,一些珍稀的物種以及具有抗蟲、病、毒、不良環境潛能的地方栽培品種已經滅絕或瀕于絕種.此外,

15、因植物育種技術的開展,高產品種單一化趨勢日益明顯,植物遺傳根底越來越窄.因此,利用植物組織和細胞保存種質,所占空間小,基因型穩定,受外界影響小,同時也便于種質交換和轉移,防止有害病蟲的人為傳播.然而,在兜蘭屬植物的種質資源保存技術方面國內外仍然是空白.2.3.3傳粉生物學HansB?nziger從1990到1994年共花了224小時持續在泰國常綠林里觀察紫毛兜蘭,發現其周圍大約有100種雙翅目食財蠅,在15個實驗對象中有效花粉傳播者主要為雌性的Episyrphusalternans,Syrphusfulvifacies,Betasyrphusserarius.紫毛兜蘭靠花色和散發出類似尿素的味

16、道來吸引遠距離的昆蟲,退化雄蕊可能是模擬一滴蜜汁或露水)引誘近距離昆蟲.當昆蟲被吸引時,便著陸于中央一突疣(偽裝成棲木),因限制不住而滑入兜內.為了預防昆蟲飛出,唇瓣形成囊狀,所以昆蟲只能擦過柱頭,粘上花藥逃出去.粘稠的花藥至少可以持續8周的生活力,但只有8%勺植株可以產生痂果33.劉可為34等對杏黃兜蘭的傳粉生物學進行研究,結果發現杏黃兜蘭的繁育系統是兼具異交和自交的混合交配系統.杏黃兜蘭是一種食源性欺騙的植物,它模仿食源性植物黃花香.止匕外,通過檢測還發現杏黃兜蘭的花粉為脂質；花粉活力和柱頭可授性在花朵開放期內具有同步性,而花粉在柱頭凋落后仍具活力,去除了雄蕊可明顯延長花朵開放時問.2.4

17、兜蘭屬植物的保護珍稀瀕危植物的保護主要有三種方法,第一種是就地保護,即保護珍稀瀕危植物的生境,讓其自然繁殖；第二種是遷地保護,即利用植物園等保育基地,創造人為環境進行保護；第三種是自然回歸,即通過人工繁育種苗再回歸種植到自然中去,使瀕危植物的種群迅速擴大,在目前來說,遷地保護仍是珍稀瀕危植物最實用的最有效的物種保護手段：35-360國外對兜蘭屬植物的引種栽培已有較為系統的研究所381邱園更是遷地保護了世界上60多種兜蘭屬植物.我國對兜蘭屬植物的引種馴化和遷地保護的研究起步較晚,目前僅有少數報道,如貴州省亞熱帶植物研究所和黔西南州綠緣動植物科技開發在對所引種的24種兜蘭的成活率、繁殖率、開花率和

18、長勢進行綜合分析的根底上,認為杏黃兜蘭、硬葉兜蘭在貴州地區具有較強的適應性、彩云兜蘭的適應性較差：39：;中國科學院華南植物園曾宋君1肛等科研人員對我國國產的所有27種兜蘭進行了引種栽培并獲得成功,但一些種類在華南地區引種栽培時與在貴州地區栽培時的適應性表現出巨大的差異性,如杏黃兜蘭、硬葉兜蘭葉片變小、開花率低,表現出較差的環境適應性,而彩云兜蘭盡管產于云南,卻表現出很好的適應性；曾宋君也等在此根底上又對我國國產的兜蘭屬植物欣賞價值進行了評價對對其在華南地區的應用前景進行了分析.其它有關兜蘭屬植物的引種馴化研究主要集中在杏黃兜蘭上,如劉仲健等對杏黃兜蘭的保育生態學研究中,將杏黃兜蘭引種到深圳人

19、工疏林下栽培時,生長良好并繁殖出許多無性的克隆分株,將繁殖的克隆分株重返原產地能正常開花；皮秋霞：43：等在對杏黃兜蘭的花發育過程研究及引種栽培時發現,不同時間引種到昆明栽培等研究了不同的遮蔭和施肥處理對杏黃蘭的葉綠素含量和葉片的長、寬和厚度的影響.劉曉燕研究不同的栽培基質對瘤瓣兜蘭(P.callosum)的生長和凈光合作用率的影響：44102022年至2022年,我們已引種到44種國外兜蘭屬植物并在種華南植物園保育溫室中栽培,所有種類均成活,36種已開花,但引種成活率、生長狀態和開花率均表現出較大的差異45.羅毅波46等在了解了國際蘭科植物研究和保育的最新進展和開展趨勢的根底上,提出國內關于

20、蘭科植物保育的研究與國際同類工作相比存在不小的差距.他們認為蘭科植物由于其單個果實內具有成千上萬顆種子,因而利用種子進行大規模繁殖就成為蘭科植物遷地保護的重要手段.李昂47采用空間自相關分析方法對硬葉兜蘭(Paphiopedilummicranthum)和獨花蘭(Changnieniaamoena)4個天然群體的小尺度空間遺傳結構進行了研究,以探討兩種蘭科植物群體內遺傳變異的分布特征及其形成機制.結果說明,適時的遷地保護對硬葉兜蘭是必要的.上述研究結果有助于進一步了解物種的進化歷程和瀕危機制,并且能為制定有效的保護策略和舉措提供科學依據.李宗艷照基于ISSR的硬葉兜蘭居群遺傳多樣性研究結論與S

21、RAP(據和李昂的初步檢測結論是一致的,即硬葉兜蘭種水平遺傳多樣性遠高于居群水平,但與黃家林等報道的較高水平的居群遺傳多樣性(PP氏80.28%,H0.2847,I=0.4236)結果有較大出入49.李宗艷等通過利用SRAFW記對167個滇東南硬葉兜蘭個體的遺傳多樣性和遺傳結構研究50,結果說明居群間遺傳距離與地理距離無顯著相關性.居群當前較高的遺傳分化與其交配系統有關.高麗霞等通過采自廣西木論自然保護區的天然居群的40份帶葉兜蘭,進行遺傳多樣性的SRA叫析51,結果說明40份帶葉兜蘭種質的遺傳變異處于較低水平,遺傳多樣性不夠豐富.這些工作都為今后對兜蘭的保護提供了根本的依據.2.5兜蘭屬植物

22、的利用兜蘭屬(Paphiopedilum)的雜交育種已有150多年的歷史,目前已有20262個雜交種在英國皇家園藝協會(RHS)登錄回.由于對兜蘭野生種質資源的保護更加嚴格,兜蘭雜交種已越來越受到蘭花愛好者的青睞,所以利用優良的兜蘭雜交種為親本進行新品種選育,能大大縮短新品種培育的時間530充分利用我國豐富的兜蘭種質資源進行新品種的培育； 兜蘭與杓蘭屬、美洲兜蘭屬來自同一個祖先,關系極為密切,可以充分利用我國豐富的杓蘭屬資源進行遠緣雜交54.著重進行多花長瓣型和大花型兜蘭的育種.盡管目前多花長瓣型兜蘭在我國花卉市場很少見,但其獨特的欣賞價值十分符合我國大眾的審美.國產兜蘭主要分布于熱帶過渡地區

23、(南亞熱帶),主產于西南各省區； 國產兜蘭屬中最原始的短瓣亞屬絕大局部種類僅分布在滇東南地區與貴州、廣西連成一片的巖溶地貌的石灰巖地區,而兜蘭屬中較進化的兜蘭亞屬大局部種類在本區皆有分布.這說明滇東南的石灰巖地區可能是兜蘭屬的起源中央55.我國滇東南地區具有重大的科研價值、景觀價值、文化價值和產業提升價值.我國原種兜蘭資源在20世紀80、90年代已遭受了較為強烈的人為破壞,很多原種被大量采挖,到達了瀕危的地步.自20世紀80年代以來,中國科學院植物園一直從事兜蘭屬植物的引種、馴化工作,現已引種栽培寬瓣亞屬及兜蘭亞屬的野生兜蘭13種,目前均表現良好.昆明園林科研所已成功引種野生兜蘭13種,存苗2

24、萬余株,栽培于昆明植物園的蘭圃560鄒秉左57曾從云南、貴州、廣西、廣東、海南等省引種了許多我國野生兜蘭.另外,深圳梧桐山苗圃總場收集了大量的野生兜蘭,并發現了一些新的種和變種；北京中山公園栽培蘭花的時間較長,并且積累了兜蘭栽培的一些成功經驗.北京中山公園栽培蘭花的時間較長,并且積累了兜蘭栽培的一些成功經驗.但與蝴蝶蘭、大花蕙蘭、石解等其他的欣賞性蘭花相比,還有很大的空間.綜上所述兜蘭屬的研究在分子上有很大的進展,都為制定有效的保護策略和舉措提供了科學依據；在西南各省區是兜蘭分布較多的區域,各有關門應增強宣傳,嚴格執法,增強人們的環保意識.2.6基于保護研究存在問題兜蘭由于其具有極高的欣賞價值

25、和較高的經濟價值,在國內外受到了廣泛深入的研究,主要集中在原生種質資源、雜交育種、栽培、繁殖、花期調控等方面的研究,現已培育了數以千計的雜交種,但是相比其他蘭科植物而言還存在差距主要有以下幾點：(1)兜蘭屬遺傳多樣性的研究較少.(2)缺乏對兜蘭屬植物更為準確和詳盡的分子資料(3)兜蘭屬植物的就地保護率極低.(4)兜蘭屬植物保護的關注度與保護等級極低.(5)以兜蘭屬植物為主要保護對象的自然保護區數量很少(6)很多自然保護區綜合科考資料較為粗糙,疏漏較多.參考文獻：1BRAEMG,CHIRONG.PaphiopedilumM.Paris:Tropicalia,1988.2CRIBBPJ.TheGe

26、nusPaphiopedilum(Ed.2)M.KotaKinabalu:NaturalHistoryPublications(Borneo),1998.3劉仲健,張建勇,茹正忠,等.蘭科紫紋兜蘭的保育生物學研究J.生物多樣性,2022,12(5):509-516.2沐建華.文山兜蘭屬植物多樣性研究J.文山學院學報,2022,(3):124-1314羅毅波,賈建生,王春玲.初論中國兜蘭屬植物的保護策略及其潛在資源優勢J.瀕危物種科學通訊,2022,4(2):11-20.5劉仲健,張建勇,茹正忠,等.蘭科紫紋兜蘭的保育生物學研究J.生物多樣性,2022,12(5):509-516.6COXAV,

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28、緣群的研究J.云南植物研究,2000,22(4):390-394.10朱亞艷,王港,侯娜,王蓮輝.貴州南部野生兜蘭SRAPfi傳多樣性分析J.西南林業大學學報,2022(1):10-14.11K.F.Rodrigues;S.V.Kumar.Isolationandcharacterizationof24microsatellitelociinPaphiopedilumrothschildianum,anendangeredslipperorchidJ.ConservationGenetics,2022,10(1):127-130.12曾宋君.兜蘭引種繁殖雜交育種和SSR引物開發研究J.中國科學

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33、furtherdevelopmentofplantletsofPaphiopedilumciliolarePfitz.invitroJ.ScientiaHorticulturae,1987,34:139-153.28陳之林,葉秀嶙,梁承鄴,等.杏黃兜蘭和硬葉兜蘭的種子試管培養J.園藝學報,2022,31(4):540-54229丁長春,虞泓,劉方媛.影響杏黃兜蘭種子萌發的因素J.云南植物研究,2022,26(6):673-677.30丁長春,虞泓,劉方媛,等.杏黃兜蘭胚培養與快速繁殖J.植物生理學通訊,2022,41(1):55.31NHUTDT,TRANGPTT,VUNH,etal.Awou

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36、,1998.37CribbP.TheGenusPaphiopedilumML2nded.KotaKinabalu:NaturalHistoryPublications(Borneo),1998:22-30.38BirkLA.PaphiopedilumgrowersmanualM.2nded.California:PisangPress,2022:28-281.39羅曉青,王代谷,鄧克云,等.貴州省興義市兜蘭屬植物引種馴化研究J.安徽農業科學,2022,37(20):9459-9460.40曾宋君,陳之林,吳坤林,等.國產兜蘭屬植物的引種和栽培J.中國野生植物資源,2022,29(2):53-5

37、8.41曾宋君,夏念和,陳之林,等.國產兜蘭屬植物欣賞價值評價及其在華南地區的應用前景分析JL中國野生植物資源,2022,30(2):9-13.42劉仲健,劉可為,陳利君,等.瀕危物種杏黃兜蘭的保育生態學J.生態學報,2022,26(9):2791-2800.1043皮 秋 霞 , 嚴 寧 , 胡 虹 , 等 . 杏 黃 兜 蘭 的 花 發 育 過 程 及 引 種 栽 培 J.云 南 植 物 研究,2022,31(4):293-302.44劉 曉 燕 . 不 同 栽 培 基 質 對 兜 蘭 生 長 及 葉 片 凈 光 合 速 率 的 影 響 J.西 南 農 業 學報,2022,19(1):44

38、-4945曾宋君,陳硯,吳坤林,等.國外兜蘭屬植物的引種和栽培初報J.中國野生植物支援,32(5):62-68.46羅毅波,賈建生,王春玲.中國蘭科植物保育的現狀和展望J.生物多樣性,2022,11(1):70-77.47李昂,羅毅波,葛頌.采用空間自相關分析研究兩種蘭科植物的群體遺傳結構J.生物多樣性,2022,10(3):249-257.48李宗艷,管名媛,李靜,李名揚.基于ISSR的硬葉兜蘭居群遺傳多樣性研究J.西北植物學報,2022,36(7):13511352.49HUANGJia-Lin;LIShu-Yun;HUHong.ISSRandSRAPMarkersRevealGeneti

39、cDiversityandPopulationStructureofanEndangeredSlipperOrchid,Paphiopedilummicranthum(Orchidaceae)J.PlantDiversity,2022,36(2):209-218.50李宗艷,李靜,曾萬標,等.滇東南硬葉兜蘭核心種質區群體遺傳結構J.植物遺傳資源學報,2022,14(3):407-413.51高麗霞,覃國樂,易桂萍.帶葉兜蘭遺傳多樣性的SRAf析J.南方農業學報,2022,45(10):1734-1738.52MaiF.TheGenusPaphiopedilumM.Taibei:ShuqinPr

40、ess,1987:50-52.53曾宋君,田瑞雪,陳之林,等.兜蘭屬植物雜交育種研究進展J.北方園藝2022(15):103-10654CoxAV,AlbertVA,ChaseMW.Phylogenetiesoftheslipperorchids(CypripedioideaeOrehidaceae):NuclearrDNAITSsequencesJ.PlantSystEvol,1997,208:197-223.55龍波,龍春林.兜蘭屬植物及其研究現狀J.自然雜志,2022,28(6):341-344.56李潔.2022.云南野生兜蘭的引種栽培.中國野生植物資源,21(2):61-63.57鄒

41、秉左.1998.兜蘭及其引種栽培.花木盆景,(5):10-11.11二、研究方案1 .研究內容、研究目標及擬解決的關鍵問題1.1研究內容1不同干擾程度對種群遺傳多樣性指數的變化；2不同干擾程度對種群的遺傳分化程度和基因流的水平；遺傳多樣性指標：觀測等位基因數Na、有效等位基因數Ne、Neis基因多度H、香儂指數I、多態位點比率PPB、遺傳分化系數Gst、種群的遺傳分化指數Gst、分子遺傳變異組成AMOVA等.1.2研究目標采用葉綠體轉錄間隔基因psbA-trnH和SSR標記對3個天然種群和3個人工干擾種群樣本進行PCR擴增、PCR產物測序和檢測,比擬天然種群和干擾小種群在種群內和種群間的遺傳多

42、樣性指數、分子遺傳變異組成、遺傳分化程度的差異,評估人為過度采集對種群遺傳多樣性的影響.1.3擬解決的關鍵問題1干擾對種群不同遺傳多樣性指數的影響；2干擾對種群內遺傳變異組成的影響；3干擾對種群的遺傳分化程度；122.擬采用的研究方法、技術路線、實驗方案及可行性分析2.1擬采用的研究方法(1)樣品的米集：米集時各種選取時,每隔兩米米取生長健壯、無病蟲害的葉片混合；葉片采集后低溫保存,帶回實驗室后放入-70C保存,用液氮研磨后保存于-70C.(2)基因組DNA的提取：采用改進CTAB方法從葉片中提取硬葉的DNA.(3)引物篩選和PCR擴增反響體系的優化：應用已開發cp-SSR引物和psbA-tr

43、nH引物對硬葉兜蘭基因組DNA進行擴增反響并優化反響體系.(4)凝膠電泳檢測：瓊脂糖凝膠電泳法對擴增產物進行檢測.(5)葉綠體間隔基因擴增數據處理：對psbA-trnH結果進行測序,將獲得的基因序列進行NCBI網上的blast比對,采用DNASTAR軟件對獲得的基因序列進行比對.(6)cp-SSR程序反響產物的數據處理： 依據電泳圖譜中laddermarker標準分子量對擴增出的條帶進行分子量編碼,同一引物組合擴增的分子量相同的條帶視為同一位點.電泳圖譜中的每個樣品的擴增帶按有或無記錄,有帶賦值為1,無帶賦值為0,得到原始數據矩陣,用PopGen32軟件計算各遺傳多樣性指標；基于Neis遺傳距

44、離用NTSYS-pc2.1軟件采用UPGMA方法進行居群親緣關系構建；分子遺傳變異的方差分析(AMOVA)和Mantel檢測用GenALEX軟件計算.2.2技術路線硬葉兜蘭樣品的采集一基因組DNA的提取一引物篩選和PCR擴增反響體系的優化一凝膠電泳檢測一測序一數據處理2.3可行性分析1、已經采得了天然種群和干擾種群樣品并保存.2、SSR具有豐富的多態性,SSR標記的優點在于SSR產物進行測序膠電泳別離具有單堿基的高分辨率,遺傳信息量大,一個SSR座位最多可以檢測到26個等位基因,能夠更好的分析硬葉兜蘭的遺傳多樣性.它在牡丹親緣關系中的應用很廣泛.在基于SSR特點之上,利用葉綠體DNA(chlo

45、roplastDNA)的遺傳特點,使cp-SSR在支取群體遺傳分析和系統發育研究中優勢更大.3、psbA-trnH序列中的psbA-trnH片段是一段位于psbA和trnH基因之間的非編碼序列,進初速率較快.trnH-psbA序列具有引物通用性較好、 擴增成功率較高等特點,并且平均長度較短,有利于對降解材料的擴增；而硬葉兜蘭居群的psbA-trnH體系已經得到初步建立.4、學院實驗室相關儀器(如PCR擴增儀、凝膠電泳儀)齊備.133、本研究的特色與創新之處(1) SSR標記的種群研究優勢；數量豐富,覆蓋整個基因組,揭示的多態性高；具有多等位基因的特性,提供的信息量高；以孟德爾方式遺傳,呈共顯性

46、；每個位點由設計的引物順序決定,便于不同的實驗室相互交流合作開發引物.(2)葉綠體基因組(chloroplastDNA,cpDNA)呈單親遺傳,由于葉綠體為母系遺傳(Maternalinheritance)是指兩個具有相對性狀的親本雜交,不管正交或反交,子一代總是表現為母本性狀的遺傳現象,可以用于檢測蘭科植物種子擴散格局.在硬葉兜蘭上的研究報告較少.(3)種群遺傳多樣性指數進行人干擾影響的分析,定量評價各個參數的變化,為種的保育提供理論依據.4、研究方案及預期研究結果2022年3月一2022年7月：收集整理與論文相關的文獻資料,確定論文的題目,初步擬定本論文的研究方案,形成研究思路.2022年

47、8月2022年1月：進行實驗研究以及數據收集,完成開題報告和中期考核.2022年2月2022年8月： 進行相關的實驗研究工作,撰寫并發表一篇研究性論文,通過論文開題報告,完成論文初稿.2022年9月2022年1月：繼續研究分析,根據情況調整進度,完成論文的撰寫.2022年3月一2022年6月：完成論文的最后修改,做好辯論前的工作.預期研究結果篩選出適合于硬葉兜蘭居群鑒定的cp-SSR,引物,并得到清楚、重復性好的條帶,用于多態性分析,揭示出各種及品種在遺傳上的差異性.測出葉綠體轉錄間隔基因(psbA-trnH)進行psbA-trnH序列分析.根據統計數據得出各遺傳多樣性指數結果；基于Neis遺傳距離構建出聚類分析樹狀圖,分析得出各個硬葉兜蘭居群間分子遺傳變異的方差.三、研究根底141、已參加過的相關研究,作和已取得的研究,作進展到目前為止,本人對滇東南6個野生居群展開研究,用改進的CTAB方法成功的提取植物葉片DNA,并用此DNA篩選出葉綠體間隔基因(psbA-trnH)條帶明亮較好的條帶,對引物進行確定最正確退火溫度,進而對PCR體系進行優化,確定最正確反響體系.在課余時間查閱大量的國內外文獻,查閱此研究領域的概況和缺乏之處,同時在圖書館找出相關的書籍進行仔細研究,為分子研究打下 f 的根底.在網上學習相關儀器的使用方法,并做筆記記錄.對植物分子標記進行了系統的學習,保證能