1、心肌細(xì)胞分離及培養(yǎng) 心肌細(xì)胞（myocardial cells）體外培養(yǎng)及建立病理模型，可挺直觀看藥物對(duì)活細(xì)胞作用及其動(dòng)態(tài)過程。并可對(duì)其作用機(jī)制舉行深化討論。 據(jù)心肌細(xì)胞生物學(xué)特性，目前討論所專心肌細(xì)胞均為原代培養(yǎng)有限細(xì)胞系。早期討論心肌細(xì)胞采自胚胎或新生動(dòng)物心臟，目前已能按照需要采納成體動(dòng)物心臟。主要供體動(dòng)物為小鼠、大鼠、豚鼠、家兔等，亦可用犬及人胚胎。分別心肌細(xì)胞的辦法有機(jī)械法及酶消化法。 【材料】 1乳鼠心臟，sd大鼠（體重200300g，雌雄不限。也可用豚鼠、小鼠，雞、蛙、小型豬等）心臟或人心肌組織。 2試劑 （1）培養(yǎng)液：培養(yǎng)基（mem,dmem,dmem/f12,ml99等）、。

2、(2)消化液：、蛋白酶xiv, i型膠原酶；低鈣kh液+膠原酶i(0.5g/l)+透亮質(zhì)酸酶(0.3g/l)。 (3）灌流液及成分： 1）無鈣kh液（mmol/l)：naci 118，kcl 4.7，mgs04 1.2，kh2p04 1.2，nahc03 25，glu-cosel0，hepes 10, ph 7.4。 2）低鈣kh液：無鈣kh液中加入0.95mmo1/l cacl2。 (4）其他：5-溴脫氧嘧啶核苷(5-brdu)、鹽酸液、0.1。 3儀器及器械 langendlrff心臟灌流系統(tǒng)、凈化工作臺(tái)、c02孵箱、倒置顯微鏡、離心機(jī)、磁力攪拌器、手術(shù)器械、200目金屬篩、細(xì)胞培養(yǎng)用器皿

3、等。 【辦法】 1乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)法（未成熟心肌細(xì)胞培養(yǎng)法）哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞在胚胎期具有分裂增殖能力，舉行分別培養(yǎng)勝利率高。可利用其觀看正常心肌細(xì)胞功能特點(diǎn)、不同因素對(duì)心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響。亦可將其制備成不同損傷和疾病模型，舉行相應(yīng)藥代動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)的討論。 (1)乳鼠心肌細(xì)胞分別及細(xì)胞懸液制備 1)將誕生23天sd大鼠浸入0.1（或75）溶液中（35分鐘反復(fù)擦洗）消毒取出后斷頭，腹面對(duì)上固定于滅菌鼠板上，用碘伏消毒胸腹部皮膚，剪除胸部皮膚，充分分別皮下組織裸露視野，再用碘伏消毒胸壁。換清潔器械于劍突處胸骨左緣剪開胸壁取出心臟，置于預(yù)先裝有無血清dmem培養(yǎng)液平皿中。 2)換清潔手術(shù)器

4、械剔除心臟周邊血凝塊、結(jié)締組織等，去除心房，將心室轉(zhuǎn)移至另一盛有無血清dmem培養(yǎng)液平皿中，反復(fù)沖洗去除殘留積血。 3)換潔凈器械，將修整好的心室轉(zhuǎn)移至盛有適量0.08胰酶液燒杯中，剪成1 mm3碎塊，轉(zhuǎn)移至三角燒餅中。 4）加入剩余胰酶，輕輕吹打后置磁力攪拌器上消化（3537 ,100r/minx10min)，消化完畢后再次輕輕吹打，靜置2分鐘待其自然沉淀后，棄去上清液，向沉淀中加入胰酶溶液重新消化（條件同上），沉淀，將上清吸出加入預(yù)冷的含15胎牛血清的dmem中終止消化（粗分別細(xì)胞懸液）置冰臺(tái)上待用，沉淀部分重新消化，重復(fù)此步驟直至組織消化基本徹低，全過程以控制在60分鐘內(nèi)完成為好。將各次

5、留取的粗分別細(xì)胞懸液于冰臺(tái)上過200目網(wǎng)篩，4離心（1000r/min,10分鐘）dmem（含15）重懸制成細(xì)胞懸液。 (2)心肌細(xì)胞純化：以上所獲得細(xì)胞懸液中除心肌細(xì)胞外，尚有上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等，數(shù)量雖少但其生長(zhǎng)及增殖能力均強(qiáng)于心肌細(xì)胞，若不排解則短時(shí)光內(nèi)可大量增殖影響心肌細(xì)胞。心肌細(xì)胞的純化可用差速貼壁法或化學(xué)試劑抑制法，國內(nèi)有討論顯示以兩種辦法聯(lián)合應(yīng)用效果更好。 1)差速貼壁法：按照心肌細(xì)胞貼壁較慢，而成纖維細(xì)胞貼壁快的特點(diǎn)，將獲得的原代細(xì)胞懸液置于較大培養(yǎng)容器中（最好有足夠底面積和深度）靜置培養(yǎng)6090分鐘，認(rèn)真吸取培養(yǎng)液（富集尚未貼壁的心肌細(xì)胞）移于另一培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)。已貼壁細(xì)胞

6、基本為成纖維細(xì)胞，可做其他討論用。 2) 5-brdu抑制法：5-brdu可抑制成纖維細(xì)胞dna合成，而對(duì)極少分化的心肌細(xì)胞影響不大，可于培養(yǎng)最初的24小時(shí)在培養(yǎng)液中加入終濃度為100umol/l的5-brdu，抑制成纖維細(xì)胞增殖。 3)差速貼壁聯(lián)合5-brdu抑制：先以差速貼壁法兩次，將所獲細(xì)胞用含5 -brdu（終濃度100umol/l）培養(yǎng)基培養(yǎng)。 (3）原代細(xì)胞接種：將純化后的細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，按照不同試驗(yàn)?zāi)康呐e行稀釋接種。如：擬以單細(xì)胞為討論對(duì)象，則接種細(xì)胞的密度應(yīng)1x105/ml。據(jù)討論報(bào)道，密度為5x105/ml時(shí)，細(xì)胞可形成松疏的單層細(xì)胞網(wǎng)；密度1x106/ml、可形成單層細(xì)胞或多

7、層細(xì)胞，或形成細(xì)胞簇。較高的細(xì)胞密度利于心肌細(xì)胞搏動(dòng)趨向同步化。培養(yǎng)基中加100u/ml、100 ug/ml鏈霉素，預(yù)防細(xì)菌污染。接種后細(xì)胞置5 % c02,37恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)，間隔3648小時(shí)換培養(yǎng)液1次，培養(yǎng)34天后用法。 (4）心肌細(xì)胞觀測(cè)及鑒定：分別培養(yǎng)心肌細(xì)胞須經(jīng)相應(yīng)觀測(cè)、鑒定，確定其純度及活性方可用于試驗(yàn)討論。 2成體動(dòng)物心肌細(xì)胞分別培養(yǎng)法（成熟心肌細(xì)胞培養(yǎng)法）成熟動(dòng)物心肌細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和功能上與未成熟動(dòng)物心肌細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和功能上有很大差異，培養(yǎng)成熟心肌細(xì)胞并舉行相應(yīng)討論可了解成熟心肌細(xì)胞的生理及病理特性，對(duì)藥物的藥效動(dòng)力學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)討論較未成熟細(xì)胞更臨近臨床實(shí)際。 成體心肌細(xì)胞

8、的分別常用生物酶消化法，步驟及目的為：正常鈣濃度溶液是為了復(fù)原心跳，排空心肌間和心腔內(nèi)的殘血；無鈣溶液是為了解除細(xì)胞間的橫橋；酶溶液（低鈣）是為了溶解細(xì)胞外基質(zhì)；低鈣溶液或庇護(hù)液是為了清除組織中的消化酶，削減消化酶對(duì)心肌細(xì)胞的進(jìn)一步破壞。 （1）心肌細(xì)胞分別及細(xì)胞懸液制備 1)試驗(yàn)預(yù)備：試驗(yàn)開頭前全部灌流液首先氧飽和30分鐘。灌流系統(tǒng)以37預(yù)熱的70灌洗15分鐘、無菌去離子水清洗10分鐘，在動(dòng)物麻醉開頭前5分鐘換37無鈣kh液循環(huán)灌流，調(diào)節(jié)流速為3 ml/min，同時(shí)用100% 02繼續(xù)飽和。灌流液注重排空氣泡。每次試驗(yàn)結(jié)束后用70的和去離子水清洗系統(tǒng)，確保其潔凈。 2）大鼠乙醚麻醉，無菌術(shù)開

9、腹，由腔靜脈注入500u/kg肝素。開胸，于主動(dòng)脈近心臟出口處繞線打一活結(jié)，在其遠(yuǎn)端開一小口向心臟內(nèi)插入灌流管（穿過主動(dòng)脈瓣），另在右心房開口，啟動(dòng)灌流，將預(yù)留結(jié)扎線扎緊。將心臟與周圍組織分別、取出，清理周圍多余組織后與langendliff心臟灌流系統(tǒng)銜接，以無鈣kh液非循環(huán)灌流（5 ml/min )10分鐘，換酶消化液循環(huán)灌流1012ml/min，持續(xù)1530分鐘，觀看心臟擴(kuò)張、泛白、松軟時(shí)停止消化。 3)由灌流裝置上取下心臟，于冰冷無鈣kh液中剪去心室以外組織，將心室部剪碎，37輕搖10分鐘，200 um濾網(wǎng)過濾，濾液700r/min離心1分鐘（有討論者實(shí)踐認(rèn)為不離心自然沉淀即可，離心易

10、造成細(xì)胞損傷），棄上清液，沉淀用無鈣kh液與m199以10:1,5:1,3:1,2:1,4:3混合液逐次洗滌沉降，最后換成含雙抗的全m199培養(yǎng)基，完成復(fù)鈣。純化細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。 (2）原代細(xì)胞接種：將純化后的細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，接種于含10培養(yǎng)基中。成體心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)較未成熟心肌細(xì)胞難度大，不易貼壁，可用層黏蛋白預(yù)處理培養(yǎng)器皿(0.5 ug/cm2）幫助貼壁。 (3）心肌細(xì)胞觀測(cè)及鑒定：采納細(xì)胞形態(tài)、搏動(dòng)、免疫細(xì)胞化學(xué)等辦法鑒定細(xì)胞。 【結(jié)果與分析】 觀看培養(yǎng)基色澤變幻，是否澄清，細(xì)胞是否貼壁等，可大致推斷培養(yǎng)是否勝利，肌細(xì)胞生長(zhǎng)好壞。顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀看細(xì)胞形態(tài)、貼壁及搏動(dòng)情況。 未成熟心肌細(xì)胞：倒置顯微鏡下可見初消化下的細(xì)胞簇?fù)怼⒊蕡A形立體狀，透亮，輪廓不夠清楚。培養(yǎng)8小時(shí)后，可見心肌細(xì)胞有聚攏趨勢(shì)，細(xì)胞呈延展性貼壁生長(zhǎng)，個(gè)別可浮現(xiàn)搏動(dòng)。24小時(shí)左右，細(xì)胞顯然舒展，呈多邊形、梭形、不規(guī)章三角形等，大部分細(xì)胞浮現(xiàn)搏動(dòng)。48小時(shí)后，同一孔內(nèi)細(xì)胞表現(xiàn)同步搏動(dòng)。34天后，細(xì)胞進(jìn)一步舒展，有偽足，羅列松散，細(xì)胞之間能互相接觸交織成網(wǎng)，局部形成單層細(xì)胞，同步搏動(dòng)。 成熟心肌細(xì)胞：在倒置相差顯微鏡下觀看可見到細(xì)胞呈桿狀，邊緣清晰，表面光潔，橫紋顯然，透光度好，長(zhǎng)寬比約45:1(圖11-18)。含鈣灌流液灌注后會(huì)有部分細(xì)胞浮現(xiàn)自律性收縮。 另可采納免疫細(xì)胞化學(xué)（