1、整合素1亞基表達與人腦膠質瘤侵襲與復發的關系 作者：章翔，吳景文，郭衍，付洛安，高大寬 【關鍵詞】 腦膠質瘤 【Abstract】 AIM: To detect the expression of integrin1 gene in human gliomas and analyze its clinical significance. METHODS: The expression of integrin1 gene in 53 pieces of gliomas was detected by immunohistochemical and hybridization technique

2、in situ. The patients were followed up and their prognosis was compared. RESULTS: The positive rate of Integrin1 in gliomas of grade I to was 36.3%, 38.5%, 72.2% and 81.8% respectively. The integrin1 positive rate in gliomas of grade and was higher than that of grade I and (P<0.05). The integ

3、rin1 mRNA expression in gliomas was positively correlated with its protein expression. Patients with higher expression of integrin1 had poorer prognosis and shorter survival time. CONCLUSION: The higher expression of integrin1 is closely related with the lower differentiation and higher invasiveness

4、 of gliomas. Integrin1 may be a good indicator in predicating the prognosis of gliomas patients. 【Keywords】 integrin 1; glioma; immunohistochemistry; hybridization in situ 【摘要】 目的： 檢測腦膠質瘤中整合素1基因表達，闡明其臨床意義. 方法： 應用免疫組化和原位雜交法，分析53例人腦膠質瘤整合素1基因表達，對患者隨訪并比較其預后. 結果： 整合素1蛋白陽性率，在IIV級腦膠質瘤分別為36.3%, 38.5%, 72.2%

5、和81.8%，高級別（）高于低級別（）（P0.05），其mRNA表達同蛋白表達. 高表達整合素1的患者預后較差. 結論： 整合素1的高表達與腦膠質瘤分化程度低、侵襲性強密切相關，是預測患者預后的較好標示物. 【關鍵詞】 整合素1；腦膠質瘤；免疫組化；原位雜交 0引言 人腦膠質瘤細胞惡性增殖和侵襲生長是其病理特征之一，也是術后腫瘤復發，導致患者預后不良的主要原因. 該過程涉及腫瘤細胞粘附、基質降解、細胞遷移等多環節. 腫瘤侵襲與各種因素有關，如：整合素（integrin）、tenascin及透明質酸等1-3,其中細胞粘附分子integrin是腫瘤侵襲生長的步驟之一，它通過與細胞外基質蛋白的相互作

6、用，以及細胞間的粘附和信號傳導，促進腫瘤形成、生長、分化和轉移3. Integrin1是粘附分子家族的主要成員，它與腦膠質瘤惡性表型以及患者預后的相互關系，國內尚研究報道甚少，對此，我們采用免疫組化和核酸原位雜交法進行了初步探討. 1材料和方法 1.1材料 樣本來源人腦膠質瘤石蠟標本取自1995/1996本校西京醫院病理科手術標本蠟塊，共53例. 標本均經40 g・L-1甲醛固定，常規石蠟包埋，連續切片，厚5 m. 取材患者年齡21 74歲，平均(47±11)歲. 膠質瘤分化程度按WHO分級，級為分化較好，級為分化不良. 級11例，級13例，級18例，級11例.

7、 主要試劑和雜交探針 羊抗人integrin1 mAb和SABC試劑盒分別為Santa Crux和博士德公司產品. mRNA寡苷核酸探針由北京賽百盛生物公司合成，反義寡核苷酸探針序列為5GCAGTAAGCATCCATATC3互補于integrin1 mRNA的第16431661位點4，其相應對照正義寡核苷酸探針序列為3CGTCATTCGTAGGTATAG5. 按Boehringer Mannheim公司的地高辛寡核苷酸加尾標記試劑盒操作流程進行. 1.2方法 1.2.1免疫組化按試劑盒說明書，采用SABC法，對4 m厚系列石蠟切片進行組化染色，檢測各級腦膠質瘤標本integrin1表達. 1.

8、2.2核酸原位雜交mRNA原位雜交方法和步驟按Boehringer Mannheim公司的地高辛標記和檢測試劑盒操作流程進行. 實驗中以預雜交液代替雜交液為空白對照；陽性標本重復染色作為陽性對照，雜交前RNase消化并以正義寡核苷酸探針代替反義寡核苷酸探針為陰性對照. 雜交主要步驟：切片脫蠟水化，1×PBS/DEPC 液洗5 min×2次；40 g・L-1多聚甲醛，1×PBS后固定. 依次入pH 7.2，1×PBS溶液、0.1 mol・L-1甘氨酸1×PBS溶液， 4 g・L-1

9、 Triton X1001×PBS溶液漂洗. 經50 mg・L-1蛋白酶K在37下孵育30 min后，入4 g・L-1多聚甲醛1×PBS 溶液5 min，以1×PBS洗片后，浸入25 g・L-1乙酸酐10 min，2×SSC 10 min，然后將切片移入雜交液. 雜交液內探針濃度為50 mg・L-1，42，振蕩雜交16 h. 切片經梯度SSC和2×PBS漂洗后，加AP標記的抗Dig抗體Fab片段(濃度1800)，37, 40 min，室溫1 h，分別用TSM

10、1液和TSM2液漂洗，滴加NBT/BCIP濕盒中避光顯色46 h，TE緩沖液終止顯色，1×PBS洗5 min，中性紅復染，脫水透明，中性樹膠封片. 統計學處理：數據以百分率（%）表示，采用2檢驗. 2結果 2.1Integrin1的表達及分布Integrin1陽性染色為棕黃色顆粒，分布于膠質瘤細胞膜和細胞質. 結果判斷為隨機選擇的5個高倍視野（×400），陽性細胞數5個，即為1染色陽性. 陽性程度分級為(-)為無棕黃色顆粒，(+)為陽性細胞數占總數10%，()為陽性細胞數占總數11%50%，()為陽性細胞占總數50%以上（Fig 1）. 統計分析表明（2檢驗），級腦膠質瘤陽

11、性率明顯高于級腦膠質瘤(P<0.05），, 級間和, 級間的integrin1陽性率比較差異不顯著（P>0.05, Tab 1）. 表1Integrin1在膠質瘤中的蛋白表達（略） Tab 1Expression of integrin1 protein in glioma（略） 2.2Integrin1核酸原位雜交核酸原位雜交陽性表現為紫藍色顆粒，結果顯示integrin1 mRNA主要分布于腫瘤細胞質中，小部分位于胞核內. 顯微鏡高倍視野(×400)下計數雜交陽性腫瘤細胞. 標準為：(-)細胞質不著色；(+)細胞質有細小、稀疏、紫藍色顆粒；()細胞質較

12、密的細小、紫藍色顆粒；()細胞質明顯致密的紫藍色顆粒（Fig 2）. 統計分析表明，級腦膠質瘤integrin1 mRNA雜交陽性率明顯高于級腦膠質瘤(P<0.05)，, 級間和, 級間的integrin1 mRNA陽性率比較差異不顯著（P>0.05, Tab 2）. 圖1Integrin1在膠質瘤中的蛋白表達（略） Fig 1Expression of integrin1 protein in glioma (grade ) SABC×400（略） 圖2Integrin1在膠質瘤中的mRNA表達（略） Fig 2Expression of integri

13、n1 mRNA in glioma (grade ) NBT/BCIP×400（略） 表2Integrin1 mRNA在各級膠質瘤中的表達（略） Tab 2Expression of integrin1 mRNA in glioma（略） 2.3integrin1 表達與患者預后對53例標本中46例患者的目前生存情況進行了隨訪，其中integrin1 表達為， ，患者的生存率分別為78.5%, 52.4%, 9.12%和0%. 統計學分析表明（2檢驗），integrin1表達陽性率越低，生存率就越高，反之亦然；integrin1 表達為，患者的生存率顯著高于integrin1 表達為

14、的患者生存率（P<0.05）. 3討論 Integrin是一類由, 兩個亞基組成的跨膜糖蛋白，介導細胞與細胞基質、細胞與細胞間的粘附. 研究表明，integrin與腫瘤的惡性表型，如無限制性生長、低分化和侵襲轉移等密切相關，其惡性表型決定了腫瘤患者臨床病情的進程. 腫瘤浸潤、轉移與integrin分子表達和分布密切相關，膠質瘤細胞表達integrin分子具有不一致性，這可能與integrin分子的不同作用和膠質瘤細胞的高度異質性有一定相關性. Paulus 等5研究發現，integrin1 在正常腦組織有少量表達，integrin3和1在惡性膠質瘤組織中表達較高. Integri

15、n1能與多種亞基相結合，如integrin21, 31, 51 和61等，它們是細胞外基質膠原蛋白，纖維連接蛋白和層粘連蛋白的受體，共同參與膠質瘤的侵襲生長過程6-8. 抗integrin21, 31, 51及61抗體可使C6膠質瘤細胞體外移行能力減弱；經誘導過表達integrin1的C6膠質瘤細胞裸鼠皮下致瘤性增強；integrin31, 61與LN的結合，促進了U251， A172和T98G膠質瘤細胞的侵襲性；抗integrin1抗體可明顯抑制膠原蛋白I和IV的促U138和U373MG膠質瘤細胞的粘附和侵襲作用，這說明integrin1與膠質瘤的侵襲生長密切相關9,10. 我們的研究發現，

16、分化良好的腦膠質瘤組織integrin1陽性率明顯低于分化不良者，這與國外的有關研究結果相一致；且integrin1的高表達與腦膠質瘤組織分化程度低、高度粘附和侵襲生長等惡性表型密切相關，并可能對其惡性表型起正性調節作用；integrin1表達陽性率越高的患者，其預后越差. 本實驗結果提示，integrin1表達是膠質瘤惡性表型的具體表現，因此可作為患者預后評估的重要指標. 【參考文獻】 1 Zhang X, Wu JW, Fei Z, Gao DK, Qu Y, Liang JW. Cloning and sequencing of the fragment of human endosta

17、tin gene J. Disi Junyi Daxue Xuebao (J Fourth Mil Med Univ), 2000;21(9):1043-1045. 2 Wu JW, Zhang X, Fei Z, Gao DK, Qu Y, Liang JW, Liu XZ. Expression significance of extraoriginated angiostatinK(13) gene in human gliomas J. Disi Junyi Daxue Xuebao (J Fourth Mil Med Univ), 2000;21(9):1046-1050. 3 Hy

18、nes RO. Integrins: Versatility, modulation and signaling in cell adhesion J. Cell, 1992; 69(1) :11-25. 4 Lallier T, BronerFraser M, Thomas L, Mariznne BF. Inhibition of neural crest cell attachment by integrin antisense oligonucleotides J. Science, 1993; 259 (5095): 692-695. 5 Paulus W, Baur I, Schu

19、ppan D, Lena CW. Characterization of integrin receptors in normal and neoplastic human brain J. Am J Pathol, 1993;143(1):154-163. 6 Tonn JC, Wunderlich S. Invasive behaviour of human gliomas is medicated by interindividually different integrin patterns J. Anticancer Res, 1998;18 (4A): 25992605. 7 PijuanThompson V, Gladson CL, Good DJ. Ligation of integrin alpha5betal is required for internalization of vitronectin b