1、光度分析法5 6B -氨基丙酸和西三酮溶液在弱酸的條件下可以生成藍紫色物質7,其顏色深淺主要與B -氨基丙酸的濃度有關。因此可利用此顯色反應采用比色法定量測 量B-氨基丙酸。我在實驗中發現很多因素如濃度、pH值、反應溫度、以及反應時間等對此顯色反應有很大的影響。如忽視這些因素會使實驗產生很大的誤差。 就此顯色反應的最佳條件我做了初步的探究。試劑的配制：緩沖液的配制：配制pH=的NaAc HAc緩沖溶液B -氨基丙酸標準溶液的配制：用電子天平準確稱取 g B -氨基丙酸（生化純），溶于250ml pH=緩沖溶液中， 得到C = g/L標準溶液。西三酮試劑的配制：稱取西三酮溶于 100ml蒸儲水中

2、，得到5g/L的西三酮 水溶液。標準曲線的確定分別準確移取標準液于8個比色管中，用pH=的緩沖溶液稀釋到再加入1ml西三酮水溶液充分搖勻，將其放在沸水浴中加熱 10min。冷卻到室溫， 用7230型分光光度計在569nm下測其吸光度。以吸光度和濃度作一個標準曲線。 樣品的測定稀釋待測液于mlml,調pH值到，以相同的反應條件，測其吸光值并與上 面的標準曲線對照查出稀釋液的濃度， 再乘以稀釋倍數即為B -氨基丙酸的濃度。 標準曲線的測定結果B -氨基丙酸濃度在mlml范圍內與西三酮水溶液反應，顏色表現出由淺藍到深 藍的遞增變化。用西三酮比色法測得的一組數據得到的標準曲線如圖1：圖1標準曲線的測定

3、Fig 1 Determination of the standard curve 注：在沸水中加熱10min, B -氨基丙酸標準溶液5ml、西三酮水溶液1ml、 緩沖溶液pH二 樣品的測定分析將待測的一批稀釋50倍，母液稀釋的程度可以根據以與標準溶液在相同的 反應條件下反應，再觀察樣品的顯色程度而確定。取稀釋后白產物液1ml,用pH= 的緩沖液稀釋到5ml再加入1ml西三酮水溶液，在沸水中加熱 10min,測得如下 數據如表3:表3樣品的測定Table 3 Determination of sample 待測液序號待測液所對 吸光度A應的反應時 間1 10h2 20h3 22h濃度對顯色反

4、應的影響：實驗表明，B -氨基丙酸與西三酮水溶液在表 3所注的條件反應的最低濃度為 ml, 隨著B -氨基丙酸的濃度變大顯色逐漸變深。 當濃度大于ml時，所顯顏色過深或 生成紫色化合物影響其吸光度。當B -氨基丙酸的濃度在mml時，顏色變化明 顯而且穩定，因此，我選定此濃度范圍作為測定范圍。得到的數據如表 4：表4 濃度對顯色反應的影響Table 4 Concentration on the colorreaction標準液 的濃度(mg/ml)深藍藍紫顏色變基本淺藍 化 無色吸光度A注：在沸水中加熱10min,標準溶液的體積為5ml,加入1ml西三酮水溶液。pH值對顯色反應的影響網以ml的標

5、準溶液5ml,加入1ml西三酮水溶液在沸水中加熱10min,觀察到 的顏色變化如 表5:表5 pH值對顯色反應的影響Table 5 The influence of pH on the colorreactionpH值顏色無色淺藍淺藍藍藍深藍紅棕 色紅棕 色紅棕 色注：在沸水中加熱10min, B -氨基丙酸標準溶液5mk西三酮水溶液1ml、 緩沖溶液Ph二顯色反應隨著pH值得不同，顏色有著明顯的變化。當pH值小于時幾乎無色， 而在pH值在一時顏色變化明顯。pH值為，加熱不到二分鐘即顯色；pH值為， 加入西三酮溶液后不加熱30s左右即顯紅棕色；甫三酮水溶液在強堿的條件下帶 有明顯的淡黃色。因此

6、pH值為左右最好。故我選定 pH值為。此時顯色明顯無 干擾且穩定。溫度和反應時間的影響：實驗表明：溫度和反應時間對此顯色反應的影響很大。溫度太低，反應太慢 導致顯色時間長，而且顯色效果不好。而溫度過高，反應時間長對此反應影響 也很大，會生成紫色化合物影響其吸光度。在顯色反應中，反應時間主要根據 具體的顏色變化而定。一般來說，B-氨基丙酸濃度在mlml時，在沸水中加熱 10min即可，時間太短，反映不完全顏色梯度不明顯。時間過長，溶液揮發嚴重 也影響其吸光度。故我把反應時間定在 10min左右。其他因素的影響不同溶劑的西三酮溶液對顯色反應也有一些影響。為了區別它們對顯色反 應的影響，我做了如下實

7、驗：分別稱取西三酮三份，分別溶于乙醇、水、丙酮 各100ml中，可以觀察到：丙酮溶解西三酮的速度最快，乙醇次之。移取B-氨基丙酸標準溶液l)1ml三份，用pH值為的NaAc HAc緩沖溶液稀釋到5ml再依次 加入1ml西三酮水溶液、乙醇溶液以及丙酮溶液，在沸水中加熱。實驗表明： 在加熱2min時，乙醇溶液開始顯色；丙酮溶液的顯紅棕色；水溶液無色。在加 熱6min時，丙酮溶液的顏色加深；水溶液顯淺藍色；乙醇溶液的所顯顏色最深。乙醇易揮發，在加熱的條件下揮發更嚴重?；谶@一點的考慮，我采用甫三 酮水溶液。而西三酮的用量對此顯色反應的影響不大，可以選擇5ml的被測液與1ml(5g/l)的西三酮水溶液

8、反應。測定時，最好選擇標樣與待測液在同一水浴。 這樣可以減少誤差提高測定的準確度。另外，當被測液中含有其他的氨基酸或是含氨基的化合物也可以與西三酮發 生顯色反應，影響測定結果?？傊?，西三酮比色法作為一種B-氨基丙酸的定量檢測方法具有操作簡單、成本低的優點。只要控制好反應條件就能得到較好的 測量結果。三.西三酮比色法：1原理：氨基酸在一定pH范圍內，能與西三酮生成蘭紫色化合物。可以用比色 法定量測定。2試劑：（1）磷酸緩沖液（）制備方法如下：稱磷酸二氫鉀。定容500ml稱NAH2PO4 - 12H2O分別溶解定容500ml取磷酸二氫鉀10ml與磷酸氫二鈉190ml混合即為的緩沖液（2） 2%西三

9、酮溶液：稱西三酮1g一溶于35ml熱水一加入40mg氯化亞錫（SnC2 - H2O）攪拌過濾（作 防腐劑）一于冷暗處過夜一定容 50ml氨基酸標液稱干燥氨基酸（如異亮氨酸）一溶解定容100ml一搖勻一吸10ml于另外100ml容量瓶定容100ml,即得200Ug/ml標液3操作方法：（1）繪制標準曲線：取7個25ml容量瓶，吸取標液0于7個25ml容量瓶，加水補充至容積為4ml,然后加西三酮和緩沖液各1ml,于水浴加熱15分鐘，冷卻后定容25ml,靜置15分鐘,在570nm下測消光值,繪制標準曲線。（2）樣品測定：取樣品 （液體樣5-10ml） 一于燒杯中一加50ml水和活性碳約5g一加熱過濾

10、一 用3040ml熱水洗滌活性炭一吸澄清樣液 14ml一加甫三酮和緩沖液各1ml水浴 加熱15分鐘,冷卻定容，靜置15分鐘于570nm下測定消光值，按下式計算氨基酸含量。氨基酸含量（毫克/100克）=C/ （WX 1000） X 100C從標準曲線上查彳#得氨基酸的量（Ug）W測定得樣品溶液相當于樣品的量（g）注意事項：西三酮受陽光、溫度、濕度、空氣等影響易被氧化呈淡紅或深紅色，使用前要進行純化，方法如下：取10g甫三酮容于40ml熱水中，加一克活性炭，搖勻靜置 30分鐘，過濾，將 濾液放入冰箱中過濾，即出現蘭色結晶，過濾，用 2ml冷水洗滌結晶，置干燥 皿中干燥，裝瓶備用。茴三酮顯色法測定氨

11、基酸含量一、目的學習西三酮顯色法測定氨基酸含量的方法二、原理西三酮溶液與氨基酸共熱，生成氨。氨與西三酮和還原性西三酮反應，生 成紫色化合物。該化合物顏色的深淺與氨基酸的含量成正比，可通過測定570nm處的光密度，測定氨基酸的含量。三、試劑與材料(1)標準氨基酸溶液：配制成 L溶液。(2) , 2mol/L醋酸緩沖液：量取 86mL 2mol/L醋酸鈉溶液，加入14mL 2 mol/L乙酸混合而成。用pH檢查校正。(3)西三酮顯色液：稱取85mg西三酮和15mg還原西三酮，用10mL乙二 醇甲醴溶解。西三酮若變為微紅色，則需按下法重結晶：稱取 5g西三酮溶于1525mL 熱蒸儲水中，加入活性炭，

12、輕輕攪拌。加熱30min后趁熱過濾，濾液放入冰箱過夜。次日析出黃白色結晶，抽濾，用 1mL冷水洗滌結晶，置干燥器干燥后， 裝入棕色玻璃瓶保存。還原型西三酮按下法制備：稱取 5g甫三酮，用125mL沸蒸儲水溶解，得黃 色溶液。將5g維生素C用250mL溫蒸儲水溶解，一邊攪拌一邊將維生素C溶液 滴加到西三酮溶液中，不斷出現沉淀。滴定后繼續攪拌15min,然后在冰箱內冷 卻到4C,過濾、沉淀用冷水洗滌 3次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存， 備用。乙二醇甲醴若放置太久，需用下法除去過氧化物：在 500mL乙二醇甲醴中 加入5g硫酸亞鐵，振蕩12h,過濾除去硫酸亞鐵，再經蒸儲，收集沸點為 12 1125c的微分，為無色透明的乙二醇甲醴。(4) 60%乙醇。(5)樣品液：每毫升含50 pg氨基酸。(6)分光光度計。(7)水浴鍋。四、操作步驟1 .標準曲線的制作分別取L的標準氨基酸溶液0,于試管中，用水補足至 1mL。各加 入1mL , 2mol/L醋酸緩沖液；再加入1mL西三酮顯色液，充分混勻后，蓋住 試管口，在100c水浴中加熱15min,用自來水冷卻。放置5min后，加入3mL 60%乙醇稀釋，充分搖勻，用分光光度計測定 OD570nm。(脯氨酸和羥脯氨酸與 西三酮反應呈黃色，應測定OD440nm)。以OD570nm為縱坐標，氨基酸含量為橫坐標，繪制標準曲線