1、一、實驗目的一、實驗目的1 1、了解蛋白質和氨基酸的呈色反響原理、了解蛋白質和氨基酸的呈色反響原理2 2、學習幾種常用的鑒定蛋白質和氨基酸的方、學習幾種常用的鑒定蛋白質和氨基酸的方 法。法。3 3、了解呈色反響在定性和定量分析中的運用。、了解呈色反響在定性和定量分析中的運用。一雙縮脲反響一雙縮脲反響1、原理、原理 一切蛋白質或二肽以上的多肽都有雙縮脲反響，但有雙縮一切蛋白質或二肽以上的多肽都有雙縮脲反響，但有雙縮脲反響的物質不一定都是蛋白質或多肽。脲反響的物質不一定都是蛋白質或多肽。2、試劑1尿素210%氫氧化鈉溶液31%硫酸銅溶液42%卵清蛋白溶液3、操作1 取少量尿素結晶，放在枯燥試管中。

2、用微火加熱使尿素熔化，尿素放出氨 。熔化的尿素開場硬化時，停頓加熱，構成雙縮脲。冷后，加10%氫氧化鈉溶液約1ml，振蕩混勻，再加1%硫酸銅溶液1滴，再振蕩。察看出現的粉紅顏色。添加要防止過量硫酸銅，否那么，生成的藍色氫氧化銅能掩蓋粉紅色。 2向另一試管加卵清蛋白溶液約1ml和10%氫氧化鈉溶液約2ml，搖勻，再加1%硫酸銅溶液2滴，隨加隨搖。察看紫玫瑰色的出現。劑i二茚三酮反響二茚三酮反響 2 2、試劑、試劑1 1蛋白質溶液蛋白質溶液 新穎蛋清：水新穎蛋清：水=1:9)100ml=1:9)100ml 2 20.5%0.5%甘氨酸溶液甘氨酸溶液3 30.1%0.1%茚三酮水溶液茚三酮水溶液4

3、40.1%0.1%茚三酮茚三酮- -乙醇溶液乙醇溶液3 3、操作、操作1 1取取2 2支試管分別參與蛋白質溶液和甘氨酸溶支試管分別參與蛋白質溶液和甘氨酸溶液液1ml1ml，再各加，再各加0.5ml 0.1%0.5ml 0.1%茚三酮水溶液，混勻，茚三酮水溶液，混勻，在沸水浴中加熱在沸水浴中加熱1212分鐘，察看顏色由粉色變紫分鐘，察看顏色由粉色變紫色再變藍。色再變藍。2 2在一小塊濾紙上滴一滴在一小塊濾紙上滴一滴0.5%0.5%甘氨酸溶液，甘氨酸溶液，風干后，再在原處滴一滴風干后，再在原處滴一滴0.1%0.1%茚三酮乙醇溶液，茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干顯色，察看紫紅色斑點的出現。在微火旁烘干

4、顯色，察看紫紅色斑點的出現。劑i劑i三黃色反響三黃色反響1、原理、原理2 2、試劑、試劑1 1雞蛋清溶液雞蛋清溶液2 2頭發頭發 3 3指甲指甲 4 40.5%0.5%苯酚溶液苯酚溶液 5 5濃硝酸濃硝酸 6 60.3%0.3%色氨酸溶液色氨酸溶液7 70.3%0.3%酪氨酸溶酪氨酸溶液液8 810%10%氫氧化鈉溶液氫氧化鈉溶液33、操作、操作 向向6 6個試管中分別按下表參與試劑，察看各管出個試管中分別按下表參與試劑，察看各管出現的景象，有的試管反響慢可略放置或用微火加現的景象，有的試管反響慢可略放置或用微火加熱。待各管出現黃色后，于室溫下逐滴參與熱。待各管出現黃色后，于室溫下逐滴參與10

5、%10%氫氧化鈉溶液至堿性，察看顏色變化。氫氧化鈉溶液至堿性，察看顏色變化。劑i管管 號號1 12 23 34 45 56 6材材 料料（滴）（滴）蛋白蛋白質質溶液溶液4 4指甲指甲 少許少許頭發頭發 少許少許0.5%0.5%苯酚苯酚4 40.3%0.3%色氨色氨酸酸4 40.3%0.3%酪氨酪氨酸酸4 4濃硝酸濃硝酸（滴）（滴）2 2404040404 44 44 4現現 象象 劑i四乙醛酸反響四乙醛酸反響 1、原理、原理紫紅色紫紅色劑i2 2、試劑：、試劑：(1) (1) 蛋白質溶液蛋白質溶液 雞蛋清：水雞蛋清：水1 1：2020(2 (2冰醋酸冰醋酸(3) (3) 濃硫酸濃硫酸( (分析

6、純分析純) ) 3 3、操作、操作 向試管中加數滴蛋白質溶液，再加冰醋酸約向試管中加數滴蛋白質溶液，再加冰醋酸約1ml,1ml,傾斜傾斜試管，謹慎地沿著管壁加濃硫酸試管，謹慎地沿著管壁加濃硫酸(A(AR R) )約約1ml1ml，使，使其重疊，勿使兩者混合。靜置后，察看在兩液界面其重疊，勿使兩者混合。靜置后，察看在兩液界面上出現的紅紫色環，于水浴中微熱，可協助顏色構上出現的紅紫色環，于水浴中微熱，可協助顏色構成。成。 用用20%20%白明膠作乙醛酸反響。白明膠分子中無色氨酸，白明膠作乙醛酸反響。白明膠分子中無色氨酸，所以不呈此反響。所以不呈此反響。劑i (五)考馬斯亮藍反響1、原理考馬斯亮藍G250具有紅色和藍色兩種顏色。在酸性溶液中，其以游離存在呈棕紅色；當它與蛋白質經過疏水作用結合后變為藍色。它染色靈敏度高，比氨基黑高3倍。反響速度快，約在2分鐘左右時間到達平衡，在室溫一小時內穩定。在0.011.0mg蛋白質范圍內，蛋白質濃度與A595nm值成正比。所以常用來測定蛋白質含量。2、試劑 1蛋白質溶液雞蛋清：水=1：20 5 ml 2考馬斯亮藍染液 300 ml考馬斯亮藍G250 100mg溶于50 ml 95%乙醇中，加100 ml 85%磷酸混勻，配成原液。臨用前取原液15 ml，加蒸餾水至100 ml，用粗濾紙過濾后，最終濃度為0.01%