1、 廣州大學Guangzhou University報告人：田裕昌報告人：田裕昌指導老師：韋星船老師指導老師：韋星船老師組員：組員：田裕昌、賴家雄、潘建成、田裕昌、賴家雄、潘建成、曾昭烈、余玉環曾昭烈、余玉環2012年年05月月18日日1 1、項目研究背景、項目研究背景2 2、組員分工、組員分工3 3、項目研究進展、項目研究進展4 4、實驗方案與表征、實驗方案與表征5 5、項目成果、項目成果6 6、項目經費使用情況、項目經費使用情況 苦參堿是苦參堿類生物堿的代表化合物，廣泛存在苦參堿是苦參堿類生物堿的代表化合物，廣泛存在于豆科植物苦參、苦豆子及廣豆根中，是這幾種常用中于豆科植物苦參、苦豆子及廣豆

2、根中，是這幾種常用中草藥的主要有效成分，這幾種植物是我國歷史悠久的傳草藥的主要有效成分，這幾種植物是我國歷史悠久的傳統藥物之一，具有清熱、燥濕、殺蟲、利尿等功效，其統藥物之一，具有清熱、燥濕、殺蟲、利尿等功效，其作用廣泛，效果明顯，這些藥物的主要成份之一一苦參作用廣泛，效果明顯，這些藥物的主要成份之一一苦參堿。具有廣泛的藥理作用，在腫瘤、乙肝及其他疾病的堿。具有廣泛的藥理作用，在腫瘤、乙肝及其他疾病的治療中大有發展的前途。治療中大有發展的前途。 酪氨酸酶是一種含銅的金屬氧化還原酶，在動植物、酪氨酸酶是一種含銅的金屬氧化還原酶，在動植物、微生物及人體中廣泛分布，主要來源于胚胎神經峭細胞，微生物及

3、人體中廣泛分布，主要來源于胚胎神經峭細胞，具有單酚酶和二酚酶的活性。這種酶主要參與動植物、具有單酚酶和二酚酶的活性。這種酶主要參與動植物、微生物及人體中黑色素的形成，是黑色素形成必不可少微生物及人體中黑色素的形成，是黑色素形成必不可少的物質。對于我們人體來說，酪氨酸酶是人體黑色素生的物質。對于我們人體來說，酪氨酸酶是人體黑色素生成過程中的主要限速酶，跟黑色素的生成速率成正相關，成過程中的主要限速酶，跟黑色素的生成速率成正相關，所以抑制酪氨酸酶活性可以抑制黑色素的生成。所以抑制酪氨酸酶活性可以抑制黑色素的生成。 苦參堿藥用廣泛，對酪氨酸酶活性正好有抑制作苦參堿藥用廣泛，對酪氨酸酶活性正好有抑制作

4、用，而且其抑制作用屬于非競爭性抑制，但抑制效果用，而且其抑制作用屬于非競爭性抑制，但抑制效果不是太好，要是酪氨酸酶活性降低不是太好，要是酪氨酸酶活性降低50%50%，所需的苦參，所需的苦參堿濃度為：堿濃度為：0.65-0.68 0.65-0.68 mmolmmol/L /L ，所需的濃度比較大。，所需的濃度比較大。我們根據苦參堿的結構，對它的結構進行修飾，改造，我們根據苦參堿的結構，對它的結構進行修飾，改造，希望改進原來的性能，使其對酪氨酸酶活性抑制作用希望改進原來的性能，使其對酪氨酸酶活性抑制作用有所提高，在應用中更加有效。有所提高，在應用中更加有效。 我們根據苦參堿的結構，以苦參堿為先導化

5、合物與我們根據苦參堿的結構，以苦參堿為先導化合物與芳香醛類、吡啶醛類化合物在氫化鈉的催化作用下，利芳香醛類、吡啶醛類化合物在氫化鈉的催化作用下，利用用Claisen-SchimidtClaisen-Schimidt縮合反應，合成了縮合反應，合成了9 9種新型的苦參種新型的苦參堿衍生物，并對其合成工藝進行了優化。堿衍生物，并對其合成工藝進行了優化。 為了測它們的生物活性，我們對所合成的化合物進為了測它們的生物活性，我們對所合成的化合物進行了酪氨酸酶活性的抑制實驗，篩選出了行了酪氨酸酶活性的抑制實驗，篩選出了2 2種對酪氨酸酶種對酪氨酸酶抑制活性較好的苦參堿衍生物。抑制活性較好的苦參堿衍生物。 姓

6、名學院具體分工田裕昌化學化工學院合成設計賴家雄化學化工學院合成設計潘建成化學化工學院實驗研究 曾昭烈化學化工學院分析測試 余玉環化學化工學院分析測試 2010.062010.062010.08 2010.08 調研、資料收集及方案設計調研、資料收集及方案設計 根據文獻資料，整理分析，設計實驗。根據文獻資料，整理分析，設計實驗。2010.092010.092010.12 2010.12 簡單儀器采購及原材料準備簡單儀器采購及原材料準備 對實驗過程中可以預期的簡單的儀器和試劑，如手提紫外燈，苦對實驗過程中可以預期的簡單的儀器和試劑，如手提紫外燈，苦參堿等，其他儀器在實驗過程中，視實驗需要進行購買。

7、參堿等，其他儀器在實驗過程中，視實驗需要進行購買。2011.012011.012011.11 2011.11 合成試驗、條件優化、分析測試、生物活性測試合成試驗、條件優化、分析測試、生物活性測試 探討了溫度、時間、原料摩爾比對反應產率的影響。對合成探討了溫度、時間、原料摩爾比對反應產率的影響。對合成的化合物進行了的化合物進行了1HNMR1HNMR、LC-MSLC-MS、IRIR的表征，確證了其結構。對所合的表征，確證了其結構。對所合成的化合物進行了酪氨酸酶活性的抑制實驗，發現了對酪氨酸酶具有成的化合物進行了酪氨酸酶活性的抑制實驗，發現了對酪氨酸酶具有優良抑制活性的化合物。優良抑制活性的化合物。

8、2011.122011.122012.04 2012.04 材料整理、結題、撰寫論文，投稿。材料整理、結題、撰寫論文，投稿。 我們根據苦參堿的結構，以苦參堿為先導化合物與我們根據苦參堿的結構，以苦參堿為先導化合物與芳香醛類、吡啶醛類化合物在氫化鈉的催化作用下，利芳香醛類、吡啶醛類化合物在氫化鈉的催化作用下，利用用Claisen-SchimidtClaisen-Schimidt縮合反應。縮合反應。 芳香醛與含有芳香醛與含有-氫原子的醛、酮在堿催化下所發氫原子的醛、酮在堿催化下所發生的羥醛縮合反應，脫水得到產率很高的生的羥醛縮合反應，脫水得到產率很高的，-不飽不飽和醛或酮，這一類型的反應叫做克萊森

9、和醛或酮，這一類型的反應叫做克萊森- -斯密特斯密特（ClaisenClaisen-Schmidt-Schmidt）縮合反應）縮合反應 。CRHO+CH3CCH3OOH-CHRCHCOCH3 我們根據我們根據Claisen-SchimidtClaisen-Schimidt縮合反應，設計我們的縮合反應，設計我們的合成路線。下面以其中一個為例：合成路線。下面以其中一個為例：14-14-（3 3，4 4，5 -5 -三甲氧基苯基）次亞甲基苦參堿的合成三甲氧基苯基）次亞甲基苦參堿的合成 在在100 ml100 ml干燥的三口圓底燒瓶，裝置溫度計，冷凝管干燥的三口圓底燒瓶，裝置溫度計，冷凝管( (帶干帶

10、干燥管燥管) )，油浴加熱，加入，油浴加熱，加入3.50g3.50g氫化鈉氫化鈉(10 (10 mmolmmol，60%60%，在礦物油，在礦物油中的中的50-8050-80目的微晶分散體目的微晶分散體) )，用，用20 ml20 ml無水甲苯溶解。將苦參堿無水甲苯溶解。將苦參堿2.5 2.5 mmolmmol和芳香醛（和芳香醛（3,4,5-3,4,5-三甲氧基苯甲醛）三甲氧基苯甲醛）7.5 7.5 mmolmmol溶于溶于15 15 mlml無水甲苯溶液中，在室溫和氮氣保護下的條件下，將該溶液自無水甲苯溶液中，在室溫和氮氣保護下的條件下，將該溶液自恒壓滴液漏斗中逐滴加入到恒壓滴液漏斗中逐滴加

11、入到NaHNaH的無水甲苯溶液中，加熱在的無水甲苯溶液中，加熱在7575回流反應回流反應8h8h，TLCTLC跟蹤反應。將混合物冷卻到室溫，再繼續攪拌跟蹤反應。將混合物冷卻到室溫，再繼續攪拌1414小時后小時后TLCTLC檢查發現苦參堿點消失，有新的產物點產生，停止檢查發現苦參堿點消失，有新的產物點產生，停止反應。反應如下：反應。反應如下：NNO+OCH3OCH3OCH3CHONNOOCH3OCH3OCH3NaH 加入加入5%5%鹽酸除去剩余的氫化鈉，水相用氯仿進行分離鹽酸除去剩余的氫化鈉，水相用氯仿進行分離（3 330ml30ml），上層為無機鹽類物質，下層為含有產物的混合），上層為無機鹽類

12、物質，下層為含有產物的混合物。合并有機相，用無水硫酸鎂進行干燥、過濾，濾液減壓濃物。合并有機相，用無水硫酸鎂進行干燥、過濾，濾液減壓濃縮得黃色固體，即為粗品。粗品通過硅膠層析柱，使用的洗脫縮得黃色固體，即為粗品。粗品通過硅膠層析柱，使用的洗脫劑為（劑為（V V乙酸乙酯：乙酸乙酯：V V甲醇甲醇=4:5=4:5），洗出的第二個組分經檢驗即），洗出的第二個組分經檢驗即為目標化合物。使用薄層色譜檢測分離化合物不含其他組分，為目標化合物。使用薄層色譜檢測分離化合物不含其他組分，為純凈物為純凈物 。產物結構表征：產物結構表征：14-14-（3,4,5-3,4,5-三甲氧基苯基）次亞甲基苦參堿：三甲氧基苯

13、基）次亞甲基苦參堿：Yield:43.2%. m.p. 86.3-87.6. IR(KBr),v/cm-1:1418.48,1443.12,1578.30(vAr-C=C),1639.16(vC=O),2934.67(v=C-H).ESI-MS,m/z:427M+1+1HNMR(400MHz,CDCl3)(ppm):7.28(s,1H,C-CH=C),5.30(s,2H,ArH),3.82(s,3H,-OCH3)1.58,2.04,2.81,4.66(m,4H,C7-H,C5-H,C6-H,C11-H),1.26-4.36(m,18H,C2-H,C3-H,C4-H,C8-H, C9-H ,C1

14、0-H,C12-H, C13-H,C15-H,C17-H)。苦參堿苦參堿IRIR：14-14-（3,4,5-3,4,5-三甲氧基苯三甲氧基苯基）次亞甲基苦參堿基）次亞甲基苦參堿IRIR：14-14-（3,4,5-3,4,5-三甲氧基苯基）次亞甲基苦參堿的質譜三甲氧基苯基）次亞甲基苦參堿的質譜 NNOOCH3OCH3OCH3Mw=426 14-（3,4,5-三甲氧基苯基）次亞甲基苦參堿的三甲氧基苯基）次亞甲基苦參堿的1H NMR(400MHz，氘代氯仿溶解，氘代氯仿溶解)譜圖譜圖 NNONNOOCH3NNOH3COOCH3OCH3NNOOCH3OCH3OCH3NNOOCH3OCH3NNOFNNO

15、ClNNOBrNNOCHNH2NH2A1A2A3A4A5A6A7A8A9我們的合成產物：我們的合成產物：部分產物的結構表征：部分產物的結構表征：A1A1衍生物衍生物NNOMw=366OCH3A2衍生物衍生物NNOMw=396OCH3OCH3A3A3衍生物衍生物NNOMw=426H3COOCH3OCH3A8A8衍生物衍生物1442. 451465. 701636. 552932. 77 1000 2000 3000 波數 ( cm - 1)NNOMw=415BrNNOClMw=3701344. 971377. 041463. 121616. 882925. 33 1000 2000 3000 波

16、數 ( cm - 1)A7A7衍生物衍生物A6A6衍生物衍生物1156. 871223. 031284. 391338. 421431. 021508. 081601. 031651. 692934. 75 1000 2000 3000 波數 ( cm - 1)NNOMw=354F苦參堿衍生物對酪氨酸酶活性的抑制苦參堿衍生物對酪氨酸酶活性的抑制 本實驗是利用紫外吸光光度法來測量酪氨酸酶的活性及樣品對其的抑本實驗是利用紫外吸光光度法來測量酪氨酸酶的活性及樣品對其的抑制性。紫外吸光光度法是基于物質對光選擇性吸收而建立起來的分析方法。制性。紫外吸光光度法是基于物質對光選擇性吸收而建立起來的分析方法。

17、在實驗中，我們主要是利用紫外區，酪氨酸酶活力測定是基于酪氨酸和在實驗中，我們主要是利用紫外區，酪氨酸酶活力測定是基于酪氨酸和L L DOPADOPA( (多巴多巴) )在酶催化下氧化產物在酶催化下氧化產物多巴色素在多巴色素在475nm475nm處有最大吸收，吸處有最大吸收，吸光系數光系數=3700(cm=3700(cmmol/L)mol/L)來進行的。來進行的。 在直角坐標中，多巴色素在在直角坐標中，多巴色素在475nm475nm時的吸光度對時間曲線呈一條直線。時的吸光度對時間曲線呈一條直線。而且，當所加入酶濃度不同時所得到的曲線其斜率式不同的。但是它們的而且，當所加入酶濃度不同時所得到的曲線

18、其斜率式不同的。但是它們的起點都是交于原點。因此我們規定：以每分鐘多巴色素在起點都是交于原點。因此我們規定：以每分鐘多巴色素在475nm475nm處的吸光處的吸光度度(A475)(A475)增加增加0.0010.001為一個酶活力單位。所以，通過測定酶催化反應體系為一個酶活力單位。所以，通過測定酶催化反應體系的的A475A475隨時間的增長直線，從直線斜率即可求得酶活力。我們把酶活力下隨時間的增長直線，從直線斜率即可求得酶活力。我們把酶活力下降一半時所加入抑制劑的濃度（降一半時所加入抑制劑的濃度（IC50IC50）當作評價抑制劑效果的標準。）當作評價抑制劑效果的標準。A4A4對酪氨酸酶抑制作用

19、達到對酪氨酸酶抑制作用達到50%50%時的濃時的濃度為度為ICIC5050=0.5771mmol/L =0.5771mmol/L 經過測試比較，衍生物經過測試比較，衍生物A4A4和和A6A6對酪氨酸酶抑制活性較好對酪氨酸酶抑制活性較好 。1 1、項目創新點、項目創新點 創新之處在于參照從天然植物中分離、鑒定出的對酪氨酸酶具有抑制創新之處在于參照從天然植物中分離、鑒定出的對酪氨酸酶具有抑制作用的苦參堿，將苦參堿芳香醛類、吡啶醛類化合物在氫化鈉的催化作用作用的苦參堿，將苦參堿芳香醛類、吡啶醛類化合物在氫化鈉的催化作用下，利用下，利用Claisen-SchimidtClaisen-Schimidt縮

20、合反應，合成一系列對酪氨酸酶具有抑制作縮合反應，合成一系列對酪氨酸酶具有抑制作用的苦參堿衍生物用的苦參堿衍生物, ,探究開發更新更有效的酪氨酸酶抑制劑。將化學在一定探究開發更新更有效的酪氨酸酶抑制劑。將化學在一定程度上與生物學科聯系起來。程度上與生物學科聯系起來。2 2、項目主要成果、項目主要成果 立項任務書的預期成果：立項任務書的預期成果： （1 1）合成）合成1010種苦參堿衍生物小試樣品；（種苦參堿衍生物小試樣品；（2 2）篩選出）篩選出2-32-3種合成的酪氨種合成的酪氨酸酶抑制劑；（酸酶抑制劑；（3 3）在實驗研究的基礎上形成論文）在實驗研究的基礎上形成論文1 1篇。篇。 項目實際獲得的成果：項目實際獲得的成果： （1 1） 合成合成1010種苦參堿衍生物小試樣品；（種苦參堿衍生物小試樣品；（2 2）優化了苦參堿衍生物）優化了苦參堿衍生物的合成工藝；（的合成工藝；（3 3）優選出）優選出2 2種酪氨酸酶抑制劑；（種酪氨酸酶抑制劑；（3 3）發表學術論文）發表學術論文2 2篇，篇，投稿投稿1 1篇（已錄用，見錄用證明）篇（已錄用，見錄用證明） 。發表的論文分別是：發表的論文分別是：11田裕昌，何雄，韋星船，賴家雄，潘建